流动小鼠减数分裂细胞的流式细胞仪净化
Summary
一种有效的方法，从小鼠睾丸中获得高度纯化的可行减数分裂分数描述，一个精细胞分解协议相结合的荧光激活细胞分选（FACS）。这种方法需要利用DNA含量和核密度的离散减数分裂分数的差异。
Abstract
在睾丸细胞类型的异质性和减数分裂的细胞培养模型的情况下已表现减数分裂过程中的独特差异化的方案，研究的重大障碍。已经开发了两种主要方法净化，在不同程度上，各种成人和未成熟动物的减数分裂分数：淘洗或Staput（沉淀）BSA和/或percoll梯度。这些方法都依赖于细胞的大小和密度分离减数分裂细胞 1-5 。总体而言，除少数细胞群6，这些协议未能产生足够的纯度许多减数分裂的细胞群，都需要详细的分子生物学分析。此外，这种方法通常减数分裂细胞类型可以在特定的时间，这将增加额外的复杂性水平的重复性和均匀性进行比较时，减数分裂的细胞样本进行纯化。
在这里，我们描述了一个精致的方法，使一个轻松地可视化，识别，并净化减数分裂细胞，生殖细胞，圆形精子细胞，使用流式细胞仪结合用Hoechst 33342染色7,8。这种方法，提供了一个在整个减数分裂过程中的整体快照，并允许一个高度净化可行的细胞从最减数分裂期。然后可以将这些纯化的细胞分子的变化，伴随通过减数分裂的进展，例如在基因表达9,10和核小体占用的动态变化，在减数分裂重组11热点详细分析。
Protocol
Discussion
本协议允许同时净化成年雄性小鼠的整个范围内具有非常高的纯度的减数分裂期细胞，使调查研究这一基本过程的动态。纯净细胞，可用于众多应用，核小体映射 9,10 RNA 提取11日 ，重组分子探测，蛋白质分析和多不等。然而，检测方法要适应纯化减数分裂细胞的数量。此外，这种方法的高重复性，它是可能的，池中的多个独立的各种表现在不同的日子里增加一个特定的实验所需?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这个项目是支持的，部分款项从佛罗里达州斯克里普斯和奖项数目从国家普通医学科学研究所和国家儿童健康和人类发展研究所，分别R01GM085079和R21HD061304。这是手稿斯克里普斯研究所20917。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
Referências
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