Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.
A natureza heterogênea de tipos de células nos testículos e na ausência de modelos de cultura de células meióticas foram obstáculos significativos para o estudo dos programas de diferenciação únicos que se manifestam durante a meiose. Dois principais métodos foram desenvolvidos para purificar, em diferentes graus, várias frações meiótica de ambos os adultos e animais jovens: elutriação ou Staput (sedimentação), utilizando BSA e / ou gradientes de Percoll. Ambos os métodos dependem do tamanho das células e densidade para separar células meióticas 1-5. No geral, exceto para populações de células poucos 6, estes protocolos não ceder pureza suficiente das inúmeras populações de células meióticas que são necessários para análises detalhadas molecular. Além disso, com tais métodos geralmente um tipo de células meióticas podem ser purificada em um determinado momento, o que adiciona um nível extra de complexidade quanto à reprodutibilidade e homogeneidade quando se comparam amostras de células meióticas.
Aqui, nós descrevemos um método refinado que permite facilmente visualizar, identificar e purificar as células meióticas, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas, usando FACS combinado com coloração Hoechst 33342 7,8. Este método oferece um instantâneo global de todo o processo meiótico e permite altamente purificar as células viáveis da maioria fase da meiose. Estas células purificadas podem ser analisados em detalhe para mudanças moleculares que acompanham a progressão através da meiose, por exemplo, mudanças na expressão gênica 9,10 ea dinâmica de ocupação nucleosome em hotspots de recombinação meiótica 11.
O protocolo aqui apresentado permite, simultaneamente, purificar a partir de camundongos machos adultos toda a gama de células estágio meiótico com pureza muito elevado, permitindo que os pesquisadores para estudar a dinâmica deste processo fundamental. Células purificadas podem ser usados para inúmeras aplicações que vão desde extração de RNA 9,10, mapeamento nucleosome 11, detecção molécula recombinante, análises de proteínas, e muitos mais. No entanto, métodos de detecçã…
The authors have nothing to disclose.
Este projecto foi apoiado em parte por verbas do Estado da Flórida para Scripps e os números de prêmio R01GM085079 R21HD061304 e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, respectivamente. Este é o número 20917 manuscrito de The Scripps Research Institute.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |