Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.
Het heterogene karakter van de celtypen in de testis en de afwezigheid van meiotische celkweek modellen zijn belangrijke obstakels voor de studie van de unieke differentiatie programma's die zich manifesteren zijn tijdens de meiose. Twee belangrijkste methoden zijn ontwikkeld om, te zuiveren in verschillende mate, diverse meiotische fracties uit zowel volwassen en onvolwassen dieren: elutriatie of Staput (sedimentatie) met behulp van BSA en / of Percoll gradiënten. Beide van deze methoden afhankelijk van celgrootte en dichtheid te scheiden cellen in de meiose 1-5. Het algemeen, behalve voor enkele celpopulaties 6, deze protocollen onvoldoende zuiverheid van de talrijke meiotische celpopulaties die nodig zijn voor gedetailleerde moleculaire analyses opleveren. Bovendien, met dergelijke methoden meestal een soort van cellen in de meiose kan worden gezuiverd op een gegeven tijd, die een extra niveau van complexiteit ten aanzien van de reproduceerbaarheid en de homogeniteit bij het vergelijken van de meiose celmonsters toevoegt.
We beschrijven hier een verfijnde methode die het mogelijk maakt een gemakkelijk te visualiseren, te identificeren en meiotische cellen te zuiveren, van kiemcellen te ronden spermatiden, met behulp van FACS in combinatie met Hoechst 33342 vlekken 7,8. Deze methode biedt een algemeen overzicht van het gehele meiotische proces en maakt het mogelijk om zeer zuiveren levensvatbare cellen van de meeste fase van de meiose. Deze gezuiverde cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in detail voor de moleculaire veranderingen die progressie te begeleiden door middel van meiose, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie 9,10 en de dynamiek van nucleosoom bezetting bij hotspots van meiotische recombinatie 11.
Het protocol vermeld in dit document maakt het mogelijk om tegelijk te zuiveren van volwassen mannelijke muizen het hele bereik van de meiotische podium cellen met een zeer hoge zuiverheid, waardoor onderzoekers de dynamiek studie van deze fundamentele proces. Gezuiverde cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, variërend van RNA-extractie 9,10, nucleosoom in kaart brengen van 11, recombinant molecuul detectie, eiwit analyses, en nog veel meer. Echter, detectiemethoden moeten worden…
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd mede ondersteund door geld van de staat Florida aan Scripps en toekenning nummers R01GM085079 en R21HD061304 van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen en het National Institute of Child Health and Human Development, respectievelijk. Dit is het aantal handschrift 20917 van het Scripps Research Institute.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |