Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse, dass ein Mikroplatten-Reader nutzt, um zu messen und zu klassifizieren Boden Phosphor als P Mono-, Di-P und anorganischen P. Bis zu 96 Proben auf einmal in einem Standard-Labor gemessen werden.
Abstract
Viele Arten von organischen Phosphor (P)-Moleküle existieren in Umweltproben 1. Traditionelle P Messungen nicht erkennen diese organischen P-Verbindungen, da sie nicht mit kolorimetrischen Reagenzien 2,3 reagieren. Die enzymatische Hydrolyse (EH) ist ein aufstrebendes Verfahren zur genauen Charakterisierung organischer P bildet in Umweltproben 4,5. Diese Methode ist nur in der Genauigkeit von Phosphor-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31 P-NMR)-eine Methode, die teuer ist und erfordert spezielle technische training6 übertrumpft. Wir haben eine enzymatische Hydrolyse-Methode für die Messung von drei Klassen von Phosphor (P Monoester, Diester P und anorganischen P) zu einem Mikroplatten-Reader System 7 angepasst. Diese Methode bietet den Forschern eine schnelle, präzise, kostengünstig und anwenderfreundlich bedeutet P Spezies in Böden, Sedimenten, Dünger und wenn konzentriert, aquatischen Proben zu messen. Dies ist die einzige High-Throughput-Verfahren zur Messung der Formen und Enzym-Labilität von organischen P, die in einem Standard-Labor durchgeführt werden kann. Die resultierenden Daten einen Einblick für Wissenschaftler, System Nährstoffgehalt und Eutrophierungspotenzial.
Protocol
1. Phosphorus Extraction
- Bereiten Sie eine 1L Lösung von 0,25 M Natronlauge (NaOH, 40,00 g / mol) + 0,05 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 292,24 g / mol).
- 30 ml der NaOH + EDTA-Lösung bis 2 g des nassen oder getrockneten Boden / Probe in einem 50 mL konischen Rohr.
- Inkubieren unter Rühren für 16 h bei Raumtemperatur.
- Centrifuge 3000 xg für 3 Minuten.
2. Probenextrakt pH-Regelung
- Übertragen einer 0,1 ml Aliquot auf einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen.
- Add 0.017 mL 2,5 M Essigsäure, 0,144 ml 0,4 M Acetatpuffer (70,5% von Natriumacetat [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] und 29,5% Essigsäure, pH 5,0) und 0,739 ml deionisiertem Wasser.
- Das Endvolumen eingestellt Extrakt wird 1 mL und der endgültige pH-Wert 5,0 liegen.
3. Enzyme Stammlösung Vorbereitung
- Bereiten Sie 1 L von 0,1 M Natriumacetat (CH 3 COONa, 82,03 g / mol)-Lösung, pH 5,0.
- Bereiten Sie 2 x 10 ml saure Phosphatase Stammlösungen in der Natrium-Acetat-Puffer in Schritt 3.1, so dass Endkonzentrationen je 0,5 Einheiten / ml vorbereitet sind.
Saure Phosphatase Typ I aus Triticum aestivum (Weizenkeime, GP, in der Regel 0,5 U mg-1 fest, EC 3.1.3.2)
Saure Phosphatase Typ IV-S aus Solanum tuberosum (Kartoffel, PP, in der Regel 4,6 U mg-1 fest, EC 3.1.3.2)
* Einheiten der Aktivität werden durch den Lieferanten, wobei 1 Unit als die Befreiung von 1 Mikromol Orthophosphat, um die Lösung pro Stunde bei 37 ° C definiert angegeben - Lyophilisierte Nuklease P1 (EG 3.1.30.1) aus Penicillium citrinum (Pilze, NP1, in der Regel 500 U mg -1 fest) in einem mL VE-Wasser-dieser kann nun bei 4 ° C gelagert werden für eine spätere Verwendung.
- Pipette NP1 in einem der 10 ml-Röhrchen in Schritt 3.2, so dass die Endkonzentration 2,5 Einheiten / mL NP1 ist bereit, sanft durch mehrmaliges Wenden mischen.
- Centrifuge die beiden 10 mL Enzymlösungen 3000 xg für 30 Minuten.
4. P Calibration Curve and Controls
- Bereiten Sie 1 l 1 mM Kaliumphosphat (K2HPO4, 174,18 g / mol) Stammlösung.
- 1 ml der 1 mM Kaliumphosphat-Stammlösung in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und führen sieben 0,5 ml Verdünnungsreihen.
- Entsorgen Sie die erste Röhre, so dass Sie 7 Verdünnungen von 20 nmol-0,625 nmol P. haben
- Transfer-80 ul aus jedem Röhrchen in zweifacher Ausfertigung, um Zeilen B - H eines Standard-96-Well-Platte.
- Add 80 ul von Natrium-Acetat-Puffer (Abschnitt 3.1) zu A der Spalten 11 und 12-dies ist die 0 nmol P Kalibrierpunkt. Reihe
- Jede Spalte 11 und 12 nun enthält 8 Referenzproben von 0 nmol bis 20 nmol anorganischem Phosphat.
- Spalte 10 enthält die folgenden Steuerelemente:
- Add 40 ul PP + GP Enzymlösung + 40 ul Natriumacetatpuffer (Abschnitt 3.1) zu den ersten drei Brunnen in Spalte 10.
- Zugabe von 40 ul PP + GP + NP1 Enzymlösung + 40 ul Natriumacetatpuffer auf die nächsten drei Brunnen.
- Zugabe von 40 ul Natriumacetatlösung mit 10 nmol Glucose-6-Phosphat (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 ul PP + GP Enzymlösung auf eine gut und die endgültige gut in Spalte 10 add Natriumacetatlösung statt Enzymlösung.
5. Sample + Enzyminkubation
- Jede Probe getestet wird belegen die ersten 9 Vertiefungen in 1 Reihe mit einem Standard 96-Well-Platte.
- Verteilen Sie 40 ul pH-eingestellten Sample Auszüge aus Kapitel 2 in die Vertiefungen 1-9 in bis zu 8 Zeilen.
- Nachdem alle Proben verteilt wurden * Verwendung einer Mehrkanal-Pipette PP + GP Enzymlösung Spalten 1-3, PP + GP + NP1 Spalten 4-6 und Natriumacetatpuffer (hergestellt in Abschnitt 3.1), Spalten 7-9. Verteilen
* Dieser Schritt muss schnell durchgeführt werden, um sicherzustellen, alle Proben erhalten gleichwertige Inkubationszeit. - Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem Deckel und inkubieren Proben + Enzymlösungen, Kontrollen und Kalibrierkurve genau 1 Stunde bei 37 ° C.
6. Kolorimetrische Messung der Released und Hintergrund Anorganische P
- Bereiten Sie 50 mL von jeder der folgenden Lösungen in VE-Wasser:
Lösung A *: 0,1 M Ascorbinsäure (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M Trichloressigsäure (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
Lösung B: 0,01 M Ammoniummolybdat ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
Lösung C: 0,1 M Natriumcitrat (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 M Natriumarsenat (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% Eisessig
(CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Lösung A muss täglich zubereitet werden. - Fügen Sie 25 ul Lösung SDS, 100 ul Lösung A, 20 ul Lösung B und 50 ul und der Lösung C in alle Vertiefungen in den 96-Loch-plaß. Tun Sie dies schnell mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Die Platte abdecken und inkubieren 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Die Absorption bei 850 nm in einer abstimmbaren Mikro-Platten-Lesegerät.
7. Klassifikation der P-Verbindungen
- Import von Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm (zB Microsoft Excel).
- Plot der anorganischen Phosphor-Eichkurve: 0 bis 40 nmol P auf der x-Achse und den Mittelwert der doppelten Absorptionsmessungen auf der y-Achse.
- Führen Sie eine lineare Regression und finden Sie die Gleichung der Trendlinie.
- Spalten 1-3: Direkt bewerben die Eichkurve, das ist Hintergrund anorganischen P.
- Spalten 4-6: Durchschnittliche dreifacher Ausfertigung Abtastwerte und subtrahieren Kontrollen (Enzymlösung + Hintergrund anorganischen P) von den Brutto-Absorption, das ist P aus hydrolysierbaren P Monoester abgeleitet.
- Spalten 7-9: Gleiche wie 7,5 bis subtrahieren Absorptionswerte aus den Spalten 4-6 - das ist P aus hydrolysierbaren P Diester.
- Convert Absorption Daten nmol P durch die Anwendung der Kalibrierung Gleichung freigegeben.
- nmol P freigesetzt werden können zurück zu mg P / kg des ursprünglichen Bodens bezogen werden. Alternativ kann die Beurteilung Anteile der einzelnen P-Klasse auch ein nützlicher Ansatz für die Analyse von Daten.
8. Repräsentative Ergebnisse:
Eine schnelle visuelle Überprüfung der 96-Well-Platte nach dem kolorimetrischen Chemie bietet Anhaltspunkte, ob das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Das erste, was zu überprüfen ist das Niveau der Flüssigkeit in jede Vertiefung durch das Scannen der Seite Profil der Platte. Es sollte genau 275 ul von Reagenzien in alle Vertiefungen werden. Als nächstes Sichtprüfung der Farbe des dreifachen Probenvertiefungen und doppelte Kalibrierung Brunnen. Diese technischen replizieren sollten die gleichen Blauton sein. Anschließend eine Eichkurve, die beiden Brunnen, die Glucose-6-Phosphat und überprüfen sie veröffentlicht alle 10 nmol von anorganischen P. Nach insgesamt extrahierten P gemessen wurde mittels ICP-OES oder eine alternative Methode, sicherzustellen, dass die Gesamt-P berechneten Werte mit dieser Protokoll nicht den Betrag übersteigen, von P, extrahiert wurde.
Hinweis: Eine sorgfältige Datenverwaltung in der Tabelle wird der Hut vor quantitativen Fehlern helfen. Sie werden mit viel Zahlen zu tun auf einmal so eine Vorlage erstellen, wird die Zeit gut verbracht werden.
Abbildung 1. Ein 96-Well-Platte, welche die Ergebnisse für 8 Proben (Reihen AH) und eine Eichkurve (Spalten 11 und 12). Kontrollen sind in Spalte 10. Farbintensität zu erhöhen zwischen den Spalten 1-3 und 4-6 ist darauf zurückzuführen, hydrolysiert Monoester P-Verbindungen, zwischen den Spalten 4-6 und 7-9 ist darauf zurückzuführen, hydrolysiert Diester P-Verbindungen.
Abbildung 2. Verteilung der P-Klassen in einer 0,25 M NaOH-0.05 M EDTA-Extrakt eines Vermont Bodenprobe mit High-Throughput-enzymatische Hydrolyse. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung, n = 3.
Discussion
Von Natur erfordert eine schnelle Methode mit kleinen Volumina großer Sorgfalt. Deshalb ist die wichtigste Schritte sind solche, die Pipettieren Lösungen auf den Teller. Präzise, und vor allem konsistente Pipette Technik sind wesentlich für den Erfolg dieses Tests.
Die NaOH-EDTA-Extraktion wird es den meisten P in vielen Proben in drei Klassen charakterisiert werden: Orthophosphat, Monoester und Diester P P. Böden, Dünger, Sedimente oder andere umweltschonende Probe, die NaOH-EDTA-extrahierbare P charakterisiert werden kann enthält . P bildet in Umweltproben sind nicht unbedingt stabil und diese Technik wird sichergestellt, Proben charakterisiert werden, bevor Proben, ohne dass ein Heer von Forschern beschäftigen, sind gefährdet.
Dieser Test eignet sich besonders, wenn eine große Anzahl von Proben bearbeitet werden sollen. Das Reagenz muss und Platzbedarf wurden bis auf ein erträgliches Maß (zB 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen anstatt 50 mL Glaskolben) skaliert. Diese Anpassung auch Grenzen von Abfällen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken der USGS und die Vermont Water Resources and Lake Studies Center für die Bereitstellung von Mitteln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
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