Sequencing van Bacteriële Microflora in het perifere bloed: onze ervaring met HIV-geïnfecteerde patiënten
Summary
Ons experiment zal laten zien hoe je een sequencing analyse van bacteriële soorten transloceren in het perifere bloed van HIV-positieve patiënten uit te voeren.
Abstract
De gezonde maag-darmkanaal is fysiologisch gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van de humorale en cellulaire mucosale immuunsysteem 1,2 beïnvloeden.
Microbiota is afgeschermd van het immuunsysteem via een sterke mucosale barrière. Infecties en antibiotica is bekend dat zowel de normale maag-darmkanaal barrière en de samenstelling van de ingezeten bacteriën, wat kan leiden tot mogelijke immuun afwijkingen drie veranderen.
HIV veroorzaakt een breuk in de gastro-intestinale barrière met progressieve uitval van mucosale immuniteit en lekkage in de systemische circulatie van bacteriële bioproducten, zoals lipopolysaccharide en bacteriële DNA-fragmenten, die bijdragen tot systemische activering van het immuunsysteem 4-7. Microbiële translocatie is betrokken in HIV / AIDS immunopathogenese en de respons op de therapie 4,8.
Ons doel was om de samenstelling van de bacteriën transloceren in het perifere bloed van HIV-geïnfecteerde patiënten te karakteriseren. Na te streven ons doel hebben we het opzetten van een PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen, gevolgd door een sequentie-analyse.
In het kort, is volbloed van zowel HIV-geïnfecteerde en gezonde proefpersonen gebruikt. Gezien het feit dat gezonde personen normale darm homeostase momenteel geen translocatie van microflora wordt verwacht in deze patiënten. Na de hele bloedafname door venapunctie en plasma scheiding, wordt DNA geëxtraheerd uit plasma en wordt gebruikt om een breed scala PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen 9 uit te voeren. Na de PCR product zuivering, klonen en sequencing analyses worden uitgevoerd.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar Gianni Scimone voor een uitstekende hulp bij het maken van video.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
Referências
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
