La secuenciación de la microflora bacteriana en la sangre periférica: Nuestra experiencia con pacientes infectados por VIH
Summary
Nuestro experimento muestra cómo realizar un análisis de la secuencia de translocación de especies de bacterias en la sangre periférica de los pacientes VIH positivos.
Abstract
El tracto gastrointestinal es fisiológicamente sanos colonizados por una gran variedad de microbios comensales que influyen en el desarrollo de la humoral y celular 1,2 mucosa del sistema inmunológico.
Microbiota está protegido del sistema inmune a través de una fuerte barrera de la mucosa. Las infecciones y los antibióticos son conocidos por alterar la barrera normales del tracto gastrointestinal y la composición de las bacterias residentes, lo que puede resultar en posibles anomalías inmunológicas 3.
El VIH causa una brecha en la barrera gastrointestinal con insuficiencia progresiva de la inmunidad de la mucosa y la fuga hacia la circulación sistémica de bioproductos bacterianos, tales como lipopolisacárido y fragmentos de ADN bacteriano, lo que contribuye a la activación inmune sistémica 4-7. Translocación microbiana está implicado en el VIH / SIDA inmunopatogénesis y respuesta al tratamiento 4,8.
El objetivo fue caracterizar la composición de las bacterias translocación en la sangre periférica de los pacientes infectados por VIH. Para perseguir nuestro objetivo hemos creado una reacción de PCR para el gen 16S panbacteric ribosomial seguido de un análisis de secuenciación.
En pocas palabras, toda la sangre de ambos sujetos infectados por el VIH y saludable se utiliza. Dado que los individuos sanos presentan homeostasis intestinal normal sin desplazamiento de la microflora se espera que en estos pacientes. Tras la recogida de sangre entera por punción venosa y la separación del plasma, el ADN se extrae del plasma y se utiliza para llevar a cabo una amplia gama de reacción de PCR para el gen 16S panbacteric ribosomial 9. Tras la purificación análisis de productos PCR, clonación y secuenciación se llevan a cabo.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a Scimone Gianni por su excelente asistencia con la fabricación de video.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
Referências
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- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
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