주변 혈액에 세균 Microflora의 시퀀싱 : HIV에 감염된 환자 경험
Summary
우리의 실험은 HIV 양성 환자의 말초 혈액에서 translocating 세균 종의 시퀀싱 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
건강한 위장관은 생리학적으로 체액성 및 세포 점막 면역 시스템 1,2의 발전에 영향을 공생 미생물의 큰 다양성에 의해 식민지입니다.
Microbiota은 강한 점막 장벽을 통해 면역 시스템에서 격리됩니다. 감염 및 항생제는 정상적인 위장관의 장벽 가능한 면역 이상에 3 발생할 수 있습니다 상주 세균의 구성을 모두 변경하는 것으로 알려져 있습니다.
HIV는 면역 체계 활성화 4-7에 기여하는 등 lipopolysaccharide와 박테리아 DNA 조각과 같은 세균 bioproducts,의 체계 순환에 점막 면역 및 누설의 진보적인 장애와 위장 장애에 위반됩니다. 미생물 translocation은 HIV / AIDS immunopathogenesis 및 치료 4,8에 대한 응답으로 연관되어 있습니다.
우리는 HIV에 감염된 환자의 말초 혈액에 translocating 박테리아의 구성을 특징으로 목표. 우리의 목표를 추구하기 위해 우리는 시퀀싱 분석을 다음 panbacteric 16 ribosomial 유전자에 대해 PCR 반응을 설정합니다.
간단히, 모두 HIV에 감염된 건강한 과목에서 전체 혈액이 사용됩니다. 건강한 개인이 정상적인 창자 항상성을 제시 것을 감안할 때 microflora에 대한 translocation 이러한 환자에서 예상되지 않습니다. venipuncture와 플라즈마 분리하여 전체 혈액 컬렉션을 따라 DNA는 플라즈마에서 추출 및 유전자 9 ribosomial panbacteric 16에 대한 광범위한 PCR 반응을 수행하는 데 사용됩니다. 다음 PCR 제품 정화, 복제 및 시퀀싱 분석이 수행됩니다.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오 제작과 우수한 지원 밀라노 Scimone에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
Referências
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
