Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.
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Artigo de método
Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Metabolômica Ambiental é um campo emergente que está promovendo uma nova compreensão de como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si, no nível bioquímico 1. Nuclear espectroscopia de ressonância magnética (RNM) é uma de várias tecnologias, incluindo cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), com a promessa considerável para tais estudos. Vantagens de RMN são de que ele é adequado para análises não-alvo, fornece informações estruturais e espectros podem ser consultados de maneira quantitativa e estatística em bancos de dados recentemente disponíveis de espectros metabólito indivíduo 2,3. Além disso, dados espectrais de RMN podem ser combinados com dados de outros níveis genómica (transcritômica por exemplo, genómica) para fornecer uma compreensão mais abrangente das respostas fisiológicas de taxa para o outro e ao meio ambiente 4,5,6. No entanto, de RMN é menos sensível do que outras técnicas de metabolômica, tornando difícil a APply para sistemas microbianos naturais, onde as populações de amostras podem ser concentrações de baixa densidade e metabólito baixo em comparação com metabólitos de bem-definida e facilmente extraíveis fontes, tais como tecidos inteiros, fluidos biológicos ou de células-culturas. Por conseguinte, os poucos estudos directos ambientais metabolômica de micróbios realizadas até à data têm sido limitados a cultura à base de ou facilmente definido de alta densidade, tais como os ecossistemas hospedeiro simbióticas-sistemas, construídos co-culturas ou manipulações do ambiente intestino, onde rotulagem isótopo estável pode ser adicionalmente utilizado para aumentar os sinais de RMN 7,8,9,10,11,12. Métodos que facilitam a concentração e recolha de metabolitos ambientais em concentrações adequadas para RMN faltam. Uma vez que a atenção recente tem sido dada aos metabolômica ambientais de organismos dentro do meio aquático, onde a maior parte do fluxo de energia e material é mediada pela comunidade planctônicas 13,14, desenvolvemos um método para a concentraçãoção e extração de todo-comunidade metabólitos de sistemas microbianos planctônicos por filtração. Hidrofílicos disponíveis comercialmente poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) os filtros são especialmente tratado para remover completamente os extraíveis, que podem de outro modo aparecem como contaminantes em análises subsequentes. Estes filtros tratados são então usados para filtrar amostras ambientais ou experimental de interesse. Filtros contendo o material da amostra molhada são liofilizadas e aquosa solúveis em metabolitos são extraídos directamente para a espectroscopia de RMN convencional, utilizando um tampão de extracção padronizados de potássio fosfato 2. Os dados derivados desses métodos podem ser analisados estatisticamente para identificar padrões significativos, ou integrados com outros níveis genómica para compreensão abrangente da comunidade e função do ecossistema.
Protocolo
1. Preparação filtro para remover Extraíveis
- Use 25-mm de diâmetro de poro de 0,22 um tamanho de filtros PVDF Durapore hidrofílico (Millipore). Coloque filtros em uma proveta de 500 ml limpa Pyrex usando uma pinça. Pré-lavagem três vezes com água destilada. Redemoinho bem como de enxaguar para impedir que os filtros se colem umas às outras. Adicionar 300 ml Milli-Q (Millipore) ou de água de alta qualidade equivalente. Autoclavar para facilitar a remoção completa de extraíveis a partir dos filtros.
- Decantar a Milli-Q e novamente tripla lavagem dos filtros, desta vez com Milli-Q. O uso de filtros lugar pinças individuais sobre uma superfície limpa ....
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Discussão
O método de extração e filtração metabólito demonstrado aqui permite a biomassa microbiana planctônica a ser coletadas em quantidade suficiente para metabolômica RMN. Enquanto a extracção apenas de solução aquosa solúveis em metabolitos usando KPi e 1D 1 H RMN é demonstrado, outros solventes de extracção e abordagens espectroscópicas pode ser usado. Um exemplo útil é a utilização de metanol deuterado como solvente semi-polar, que tem sido mostrado para produzir espectros de RMN superiores a partir de amostras.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Grants-in-Aid para a Investigação Científica para impugnar pesquisa exploratória (JK), e da Investigação Científica (A) (JK e SM) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão . A Riken FPR comunhão (RCE) forneceu apoio adicional. Os autores expressam sua gratidão para com os drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto para assistência técnica com RMN e análises estatísticas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| 0,22 hidrofílicos Durapore filtros PVDF, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Titular Microanálise do filtro, 25 mm, de frita de vidro suporte | Millipore | XX1002500 | |
| 3 º lugar-colector, 47 mm, em aço inoxidável | Millipore | XX2504735 | |
| KH 2 PO 4 | Wako | 169-04245 | |
| K 2 HPO 4 | Wako | 164-04295 | |
| Óxido de deutério, 2 H> 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | > |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Trituradores de aço inox incluído |
| Thermomixer conforto | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Evaporador de vácuo | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 com 5 mm de sonda TXI | |
| Ferramenta binning Spectral | Originalmente desenvolvido | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Ferramenta de anotação de metabólitos e banco de dados | Originalmente desenvolvido | SpinAssign | = Nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a si....
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Reimpressões e permissões
