核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度
Summary
微生物のプランクトンコミュニティからの代謝物抽出のための方法が示されています。コミュニティ全体のサンプリングが特別に用意されたフィルター上にろ過することにより達成される。凍結乾燥後、水性の水溶性代謝物が抽出されます。このアプローチは、自然または実験的な微生物群集のトランスオミクス研究への環境メタボロミクスの応用が可能になります。
Abstract
環境メタボロミクスは生物に対応し、生化学的なレベル1の環境と相互に作用する方法に新たな理解を推進している新興分野である。核磁気共鳴（NMR）分光法は、このような研究のためにかなりの約束で、ガスクロマトグラフィー – 質量分析（GC-MS）を含むいくつかの技術の一つです。 NMRの利点は、非標的分析に適した構造情報を提供し、スペクトルは個々の代謝物のスペクトル2,3の最近使用可能なデータベースに対して、定量的および統計的方法で照会することができますということです。さらに、NMRスペクトルデータは、互いに分類群の生理的応答と環境4,5,6のより包括的な理解を提供するために、他のオミクスレベル（例えばトランスクリプトミクス、ゲノミクス）からのデータと組み合わせることができます。しかし、NMRはAPにそれが難しく、他のメタボローム技術よりも感度が低いです。サンプル集団はそのような全体の組織、生体液または細胞培養物として明確に定義され、容易に抽出可能な情報源からの代謝物に比べて低い低密度及び代謝物濃度になります自然の微生物のシステムへのプライ。その結果、現在までに行われた微生物のいくつかの直接的な環境メタボローム研究はそのようなホスト·シンビオント·システムなどのカルチャベースまたは容易に定義されている高密度の生態系、安定同位体標識をすることができます腸内環境の共培養または操作建設に限られてきたさらに、NMR信号7,8,9,10,11,12を強化するために使用されます。 NMRに適した濃度で、環境の代謝物の濃度と回収を容易にする方法は、不足している。最近の関心は多くのエネルギーと物質の流れがプランクトンコミュニティ13,14によって媒介される水生環境内の生物の環境へのメタボロミクスに与えられているので、濃度のための方法を開発しましたるとろ過による浮遊微生物のシステムからの全コミュニティの代謝物の抽出。市販の親水性ポリ-1,1 – difluoroethene（PVDF）フィルタは、特別に完全にそうでなければ、その後の分析で汚染物質として現れることができる抽出物を除去するために扱われます。これらの処理のフィルタは、興味のある環境や実験サンプルをフィルタリングするために使用されています。湿潤試料材料を含むフィルターを凍結乾燥し、水、水溶性代謝物は、標準化されたリン酸カリウム抽出緩衝液2を使用して、従来のNMR分光法のために直接抽出されます。これらのメソッドから派生したデータは統計的に意味のあるパターンを識別するために分析、またはコミュニティと生態系の機能の包括的な理解のための他のオミクスレベルで統合することができます。
Protocol
Discussion
ここで示したろ過及び代謝物抽出法は、NMRメタボロミクスのために十分な量で収集する微生物プランクトンのバイオマスが可能になります。 KPIと1D 1 H NMRを用いて水性の水溶性代謝物の抽出のみが実証されていますが、他の抽出溶媒と分光の手法を使用することができます。一つの有用な例は、異種のサンプルから優れたNMRスペクトルを生成するために示され、常磁性イオンによる汚…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、文部科学、技術、日本省から探索研究（JK）に挑戦するための科学研究費補助金、および科学研究（A）（JKとSM）によって部分的にサポートされていました。理研FPRフェローシップ（RCE）は、追加サポートを提供。著者は、博士に感謝の意を表明する。英資近山、NMRおよび統計分析と技術支援のための恭代関山と真美岡本。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Referências
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