En metode for metabolitten utvinning fra mikrobielle planktoniske samfunn blir presentert. Hele samfunnet prøvetaking oppnås ved filtrering på spesielt forberedt filtre. Etter lyophilization, blir vandig vannløselige metabolitter ut. Denne tilnærmingen gjør det mulig for anvendelse av miljø metabolomics til trans-omics undersøkelser av natur-eller eksperimentelt mikrobielle samfunn.
Environmental metabolomics er et voksende felt som er fremme ny forståelse i hvordan organismer reagerer på og samhandle med omgivelsene og hverandre på den biokjemiske nivå 1. Nukleær magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er en av flere teknologier, blant annet gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), med betydelige løftet for slike studier. Fordeler med NMR er at det er egnet for vilkårlige analyser, gir strukturell informasjon og spektra kan spørres i kvantitative og statistiske oppførsel mot nylig tilgjengelige databaser av individuell metabolitten spektra 2,3. I tillegg kan NMR spektrale data kombineres med data fra andre omics nivåer (f.eks transcriptomics, genomikk) for å gi en mer helhetlig forståelse av de fysiologiske responser taxa på hverandre og miljøet 4,5,6. Imidlertid er NMR mindre følsom enn andre metabolomic teknikker, noe som gjør det vanskelig å apply til naturlige mikrobielle systemer der utvalg bestander kan være lav tetthet og metabolitt konsentrasjoner lavt i forhold til metabolitter fra veldefinerte og lett utvinnbare kilder som hele vev, biofluids eller celle-kulturer. Følgelig har de få direkte miljømessige metabolomic studier av mikrober utført hittil vært begrenset til kultur-baserte eller lett definert med høy tetthet økosystemer som host-symbiont systemer, konstruerte co-kulturer eller manipulasjoner av tarmen miljø hvor stabile isotop merking kan være i tillegg brukes til å forbedre NMR signaler 7,8,9,10,11,12. Metoder som fremmer konsentrasjonen og innsamling av miljø metabolitter ved konsentrasjoner egnet for NMR mangler. Siden siste oppmerksomhet har blitt gitt til de miljømessige metabolomics av organismer i vannmiljøet, hvor mye av energien og materialflyt er mediert av det planktoniske samfunnet 13,14, har vi utviklet en metode for konsentrasjonsjon og uttak av hel-samfunnet metabolitter fra planktoniske mikrobielle systemer ved filtrering. Kommersielt tilgjengelige hydrofile poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filtre er spesielt behandlet for å fjerne ekstraherbare, som ellers kan synes som forurensninger i påfølgende analyser. Disse behandles filtrene blir så brukt til å filtrere miljømessige eller eksperimentelle prøver av interesse. Filtre som inneholder den våte prøvematerialet er lyofilisert og vandig-løselige metabolitter er hentet direkte for konvensjonell NMR-spektroskopi ved hjelp av et standardisert kaliumfosfat utvinning buffer to. Dataene fra disse metodene kan analyseres statistisk for å identifisere meningsfulle mønstre, eller integreres med andre omics nivåer for helhetlig forståelse av samfunnet og økosystem funksjon.
Filtrering og metabolitten utvinning metoden demonstrert her gjør for mikrobiell planktoniske biomasse skal samles i tilstrekkelig mengde for NMR metabolomics. Mens bare utvinning av vandig-løselige metabolitter ved hjelp av KPI og 1D 1 H NMR blir demonstrert, kan andre utvinning løsemidler og spektroskopiske metoder benyttes. Et nyttig eksempel er bruken av deuterert metanol som en semi-polart løsningsmiddel, som har vist seg å produsere overlegen NMR spektra fra heterogene prøver og er mindre følsom …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttes delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research for utfordrende utforskende forskning (JK), og forskning (A) (JK og SM) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi Japan . En Riken FPR fellesskap (RCE) gitt ekstra støtte. Forfatterne uttrykke sin takknemlighet til legene. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama og Mami Okamoto for teknisk assistanse med NMR og statistiske analyser.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
DSS | Fluka | 92754 | |
Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |