Summary
식물 바이오 매스 샘플을 다수의 당화 잠재력을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 분석을 위해 자동화된 플랫폼은 96 접시와 잘 풀어 설탕의 전처리, 가수 분해 및 부량의 후속 성능 분석을위한 식물 바이오 매스의 준비를 포함한다.
Abstract
공장 리그노셀룰로오스성 바이오 매스를 만드는 다당류는 이후 biorefinery를 구축에서 사용할 수있는 당분의 범위를 생산하는 세분 수 있습니다. 이 원료는 화석 연료에 대한 현재 종속성을 대체하기 위해 지속 가능하고 탄소 중립 모두는 새로운 산업 플랫폼을, 구성 것입니다. 리그노셀룰로오스성 자료에 관찰 해체하는 말을 안들음은 식물 세포 벽 몇 가지 본질적인 특성에 의해 생산됩니다. 결정 셀룰로오스는 그러한 xylans 및 arabinoxylans 같은 매트릭스 다당류에 포함된하고, 전체 구조는 1 소화도 어려운 페놀 수지 carbon 폴리머 리그닌에 의해 쌌다입니다. 우리가 당화 2의 다양성을 평가하는 주요 세포 벽의 당화에 대한 병목 현상 또한 화면 돌연변이 및 번식 인구를 발견할 필요가 식물 재료의 소화율을 개선하기 위해. 이러한 작업은 높은 처리량 접근을 필요로하고 여기에 우리는 96 - 웰 플레이트 형식으로 당화 분석을 수행할 수 분석 플랫폼을 제시. 이 플랫폼은 다양한 식물 종 대형 인구의 lignocellulose의 소화율의 심사를 허용하도록 개발되었습니다. 우리는 많은 번호가 자동으로 시스템에 신속하게 평가하도록, 부드러운 전처리, 부분 가수 분해 효소와 설탕의 결정에 대한 반응 볼륨을 축소했습니다.
이것은 자동화된 플랫폼은 재현성 방식으로 표준 입자 크기로 공장 자재를 줄이기 위해 통제 조건 하에서 볼 밀링을 수행, 바이오 매스의 양을 밀리그램와 함께 작동합니다. 샘플 지상되면, 자동 서식 로봇 96 딥 웰 플레이트 (그림 1)의 해당 우물에 물질의 지정 및 기록된 금액을 dispenses. 일반적으로, 우리는 4 분석을 위해 복제가 4 우물에 동일한 자료를 분배. 접시가 원하는 레이아웃에있는 식물로 가득되면, 그들은 수동으로 액체 처리 스테이션 (그림 2)로 이동됩니다. 이 기지에서 샘플은 희석 염산 알칼리 중 하나와 함께 가벼운 전처리의 대상이되며 90 ° C. 최대 온도에서 incubated 전처리 솔루션은 연속적으로 제거되고 샘플은 가수 분해에 적합한 산도에게 반환하는 버퍼로 씻어서 있습니다. 샘플은 다음 50 시간 가변 길이에 대한 효소 혼합 ° C.와 incubated 아르 나누어지는는 hydrolyzate에서 가져온되고 줄이고 설탕이 자동으로 MBTH colorimetric 방법에 따라 결정됩니다.
Protocol
1. 샘플 준비
우리는 일반적으로 풀의이나 우디 식물 중 하나에서 비롯된와 함께 작동합니다. 풀의 재료의 경우 우리는 성숙에 식물을 성장하고, 노화가 완료되면 종자 개발은 우리가 마른 줄기를 수집합니다. 줄기는 4mm 세그먼트로 썰어 세 밀링 공 2 ML 튜브에 배치됩니다. 우디 자료의 경우, 샘플은 물론 나무 파일을 거친 톱밥을 접지하고 다음 추가 처리를 위해 공을 공장에 배치.
샘플은 연삭 / 역 (그림 1) 포맷 내에 선반에 배치됩니다. 이 기지는 순차적으로, grinds 믹스, 각 샘플의 무게. 샘플마다 필요한 반복의 수는 특정 입자 크기에 대한 본질적인 다양성이 결정되는 예비 실험의 일련의 지상 자료를 테스트하여 설정됩니다. 2 ML의 튜브는 하단에 피어싱하고 자료 선택된 잘 위에 유리병의 진동에 의해 적절합니다. 진동 팔은 분말의 정확한 분배에 대한 허용의 균형에서 피드백에 의해 제어됩니다. 로봇 표준 분석 / 음 4 MG를 dispenses 4 반복 대부분의 경우에 필요합니다. 이것은 20 식물 샘플 / 플레이트가 분석 수 있습니다.
2. 전처리
샘플 서식되면, 96 - 웰 플레이트는 자동 액체 처리 시스템 (그림 2)에 의해 처리됩니다. 여기 가벼운 전처리가 산성이나 알칼리성 솔루션을 350 μL를 추가하고 적응 블록에 접시를 가열하여 식물 재료에서 수행됩니다. 분석하는 동안 증발을 방지하려면 96 잘 플레이트는 실리콘 매트와 함께 봉인하고 있습니다. 전처리의 온도와 시간은 연구되고있는 재료에 따라 수정할 수 있습니다. 최대 온도는하지만, 100 ° C.입니다 엄격한 pretreatments 테스트를위한 대안 절차는 온라인에서 자료를 pretreat 및 프로세스에서 pretreatmet을 제거하는 것입니다.
3. 가수 분해
- 자료 pretreated 후, 로봇이 자동으로 전처리 솔루션, 그리고 세척, 모든 우물, 850 μL 25 MM 아세테이트 버퍼 5 번 제거합니다. rinses은 전처리 솔루션에 버퍼를 추가하고, 이후 예제에서 고체가 정착 있도록 이후 전체 볼륨의 50 %를 제거하여 실시하고 있습니다. 흡인의 높이는 우물의 바닥에서 고체를 aspirating 피하기 위해 액체 질량의 절반에서 설정되며이 방법을 사용하여 고체의 손실이 무시할 수 있습니다. 이들은 세척 후 잘의 산도는 4.5이며, 자료 효소 가수 분해를위한 준비가되었습니다.
- cellulases 및 hemicellulases의 솔루션을 포함하는 효소 혼합물은 로봇에 의해 추가됩니다. 각 우물에, 효소 혼합물의 850 μL이 총동원되고 번호판이 50 ° C 떨고 인큐베이터로 이동합니다. 표준 가수 분해는 8 H에 대해 수행하지만, 이번 실험의 목적에 적용할 수 있습니다. 풀밭에 사용되는 표준 효소 로딩은 자료 7 FPU / g이다.
4. 설탕 줄이는 감지
가수 분해 이후에 릴리스된 설탕 감소의 결정은 수정 3 - 메틸 - 2 - benzothiazolinone hydrozone (MTBH) 방법 3을 사용하여 수행되었습니다. 그것은 자동화와 같은 쉬운 단백질과 같은 성분의 간섭에 대한 이상 감염될 때문에 MBTH가 가장 적합한 방법으로 선정되었습니다. 그것이 정확하게 바이오 매스 hydrolysates에있는 농도에서 설탕을 계량 수 있도록 표준 광학 96 잘 플레이트에 적합합니다 250 μL의 최종 볼륨과 로봇 플랫폼에 사용하기 위해이 매우 민감한 방법을 수정했습니다. 아래의 모든 단계를 자동으로 수행되고 절감 설탕 세 가지 독립적인 결정은 각 당화 반응을 위해 실시되었다.
- hydrolyzate 30 μL은 깊은 우물을 판에서 가져온와 skirted PCR 96 자 판 25 MM의 아세트산 나트륨 버퍼 45 μL와 혼합되었다.
- 1N NaOH 25 μL 및 0.43 MG / ML MBTH 및 0.14 MG / ML DTT을 포함하는 솔루션을 50 μl가 추가되었습니다.
- 혼합 후, PCR 플레이트는 60 ° 온수했다 모든 96 우물에 열을의 정확히 같은 금액을 제공하는 thermocycler 또는 이와 유사한 장치 20 분 C.
- 그 결과 반응은 광학 판으로 전달했다.
- oxidising 시약 (0.2 % FeNH4 (SO4) 2, 0.2 % sulfamic 산성과 0.1 % HCL) 100 μl를 추가합니다. 최소한 1 H. 위해 잘 혼합하고 개발하기 위해 떠나
- 각 플레이트는 50 nmol, 100 nmol 150 nmol 포도당의 표준 반응을 포함해야합니다. 광학 접시는 620 nm의에서 읽을 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
분석의 종류의 예는 그림 3과 4로 표시됩니다. 모든 결과는 자동으로 플랫폼을 사용하여 얻은되었습니다. 그림 3을 다시cellulolytic 효소의 증가 금액과 지상 포플러에서 8 H의 incubations에 의해 발표 설탕을 감소에서 증가를 제공합니다. 그림 4는 산성 및 포플러 샘플 알칼리 전처리의 효과를 제공합니다. NaOH의 전처리가보다 효율적입니다 가수 분해 동안 당분의 석방을 촉진에 희석 H2SO4 전처리. 가수 분해 후 측정 당분의 금액은 전처리가 1M 이상의 NaOH의 농도를 사용하여 수행할 때 줄어 듭니다.
그림 1. 분쇄 및 바이오 매스의 96 음 형식에 대한 로봇 역
그림 2. 높은 처리량 당화 분석을위한 액체 취급 역
그림 3. 포플러 샘플에서 설탕에 해당하는 금액을 줄이는 릴리스에 다른 효소 loadings 효과
산성 전처리보다 같은 온도와 시간에 NaOH의 pretreatments 이후에 출시된 90에서 H2SO4의 다른 비율로 pretreament ° 30 분 C 이후에 릴리스된 그림 4. 포플러 샘플 당화에 다른 pretreatments의 효력. A.의 슈거스. B.의 슈거스 .
Disclosures
우리는 공개 없어요.
Acknowledgments
저자 cellulolytic 효소의 선물 Viksø - 닐슨 (Novozymes)을 감사드립니다. 이 작품은 FP7 갱신으로하고 BBSRC 프로젝트 BB/G016178 및 BB/G016194에 의해 후원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
