Colonies sélectionner et isoler de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Summary

Nous présentons un protocole de reprogrammation efficace des cellules somatiques humaines dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux codant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) et l'identification des hiPSC correctement reprogrammé par coloration en direct avec des Tra 1-81 anticorps.

Abstract

On présente ici un protocole de reprogrammation fibroblastes humains adultes humaines en cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux encodant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) en présence de sodium ^1-3 butyrate. Nous avons utilisé cette méthode pour reprogrammer passage tardif (> p10) fibroblastes adultes humaines dérivées de patients l'ataxie de Friedreich (GM03665, Coriell Repository). L'approche reprogrammation comprend protocole de transduction hautement efficace en utilisant une centrifugation répétitif de fibroblastes en présence d'un milieu contenant de virus. Les colonies hiPSC reprogrammées ont été identifiés à l'aide immunomarquage direct pour Tra-1-81, un marqueur de surface de cellules pluripotentes, séparés à partir de fibroblastes non-reprogrammés manuellement et passages ^4,5. Ces hiPSC ont ensuite été transférés sur des plaques de Matrigel et cultivés dans des conditions exemptes de desserte, directement à partir de la plaque de reprogrammation. A partir du premier passage, les colonies hiPSC démontrer caractéristique HES-lmorphologie ike. En utilisant ce protocole, plus de 70% des colonies sélectionnées peuvent être élargi avec succès et mis en place dans des lignées cellulaires. Les lignes établies hiPSC affiché caractéristiques des marqueurs de pluripotence, y compris les marqueurs de surface TRA-1-60 et SSEA-4, ainsi que des marqueurs nucléaires Oct3 / 4, Sox2 et Nanog. Le protocole présenté ici a été établi et testé à l'aide des fibroblastes adultes obtenus chez des patients ataxie de Friedreich et de contrôle des individus, des fibroblastes humains ⁶ nouveau-nés, ainsi que les kératinocytes humains.

Protocol

1. La production de virus et de la transduction Plate Phoenix cellules Ampho à une densité de ~ 7-8×10 6 pour plaque de 10 cm dans 10 ml de milieu DMEM (DMEM taux élevé de glucose, 10% de la chaleur FBS inactivé, 2 mM de L-glutamine, pas d'antibiotiques). Placer dans l'incubateur et de la culture une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. Le jour suivant, la transfection de cellules en utilisant Phoenix 12 ug d'un vecteur codant soit Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, ou GFP g…

Discussion

Étude des maladies humaines, notamment neurologiques et neurodégénératives, a été particulièrement difficile en raison de l'inaccessibilité de l'homme des modèles cellulaires adéquats. La capacité de reprogrammer des cellules somatiques faciles à obtenir en cellules souches pluripotentes induites et la possibilité de les différencier en divers types cellulaires a ouvert une possibilité de créer des modèles cellulaires de maladies génétiques. En outre, CSPi tenir une grande promesse pour l'…

Materials

Reagent	Company	Catalog number
DMEM	Invitrogen	11965
DMEM/F12	Invitrogen	11330
KSR	Invitrogen	10828
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140
Sodium butyrate	Sigma	B5887
Y27632	Stemgent	04-0012
bFGF	Stemgent	03-0002
Tra-1-81 antibody	Stemgent	09-0069
Oct3/4 antibody	Santa Cruz	sc-8628
Nanog antibody	Cell Signaling Technology	4903S
Tra-1-60 antibody	Millipore	MAB4360
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579S
SSEA4	Millipore	MAB4304
CF1 MEFs	Globalstem	GSC-6201G
Objective marker	Nikon	MBW10010
Matrigel	BD Biosciences	354277
mTeSR1	StemCell Technologies	05850
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Fugene 6	Roche	11814443001
polybrene	Sigma	H9268
Object marker	Nikon	MBW10010