我々はとレトロOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc(OSKM)をコードするベクターとライブ染色により正しく再プログラムhiPSCの識別を用いたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)TRA-にヒト体細胞の効率的なリプログラミングのためのプロトコルを提示1から81抗体。
ここに我々は1-3ナトリウム、酪酸の存在下でOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc(OSKM)をコードするレトロウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)にヒト成人線維芽細胞を再プログラミングのプロトコルを提示します。我々は、フリードライヒ失調症患者(GM03665、コーリエル医学リポジトリ)から派生した遅く通路(> P10)ヒト成人線維芽細胞を再プログラムするためにこのメソッドを使用していました。プログラミングのアプローチは、ウイルス含有培地の存在下で線維芽細胞の反復的な遠心分離を用いた高効率伝達プロトコルが含まれています。書き換えhiPSCコロニーがTRA-1-81、多能性細胞の表面マーカーのライブ免疫染色を用いて同定した、非書き換え線維芽細胞から分離し、手動で4,5継代。これらのhiPSCその後、マトリゲルプレートに移し、直接プログラミングプレートから、フィーダーフリーの条件下で増殖させた。最初の通過から始めて、hiPSCのコロニーは、hES-L特性を実証IKE形態。このプロトコルを使用して、選択したコロニーの70%以上が正常に拡大し、細胞株に確立することができます。確立されhiPSC行は表面マーカーTRA-1-60及びSSEA-4と同様に、核のマーカーOCT3 / 4、Sox2、及びNanogの特徴を含む多能性マーカーを表示されます。ここで紹介するプロトコルが確立され、フリードライヒ失調症患者と対照個体6、人間の新生児線維芽細胞と同様に、ヒトケラチノサイトから得られた成人の繊維芽細胞を用いてテストされています。
特に神経系と神経ヒトの疾患、勉強、特に十分なヒト細胞モデルの到達不能に起因する困難されています。多様な種類の細胞にそれらを区別するために誘導多能性幹細胞および潜在的に容易に得られる体細胞を再プログラムする能力は、遺伝性疾患の細胞モデルを作成する可能性を開いた。さらに、性IPSCは、再生医療の将来非常に有望なものである。したがって、多能性に体細胞を再プログ…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、フリードライヒ失調研究アライアンスとアーノルドファミリー財団とMDアンダーソンがんセンターの幹細胞と再生科学総合研究センターからのパイロット助成金によって支えられている。
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |