Мы представляем протокол для эффективного перепрограммирования соматических клеток человека в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с использованием ретровирусных векторов, кодирующих Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-тус (OSKM) и определение правильно перепрограммировать hiPSC живой окрашивания Тра- 1-81 антител.
Здесь мы представляем протокола перепрограммирования фибробластов человека взрослого человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) с использованием ретровирусных векторов, кодирующих Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-тус (OSKM) в присутствии бутират натрия 1-3. Мы использовали этот метод, чтобы перепрограммировать конце прохода (> p10), человеческие фибробласты взрослого, полученных от пациента атаксия Фридрейха (GM03665, Coriell Repository). Перепрограммирования подход включает в себя высокоэффективный трансдукции протокол, используя повторяющиеся центрифугирования фибробластов в присутствии вируса средах. Перепрограммировать колонии hiPSC были определены с использованием живых иммуногистохимическое TRA-1-81, поверхность маркера плюрипотентных клеток, отделенных от не-перепрограммировать фибробласты и вручную пассировать 4,5. Эти hiPSC затем были переданы Матригель пластин и вырос в питатель без условий, непосредственно от перепрограммирования пластины. Начиная с первого прохода, hiPSC колонии демонстрируют характерный ГЭС-лАйк морфологии. Используя этот протокол более 70% выбранных колоний может быть успешно расширили и установили в клеточных линиях. Установленные hiPSC отображаемых строк характеристика маркеров плюрипотентности включая поверхностные маркеры TRA-1-60 и SSEA-4, а также ядерных маркеров Oct3 / 4, Sox2 и Nanog. Протокол, представленные здесь была создана и протестирована с использованием взрослых фибробластов, полученных от больных атаксией Фридрейха и контроля лиц 6 человек новорожденного фибробластов, а также человеческих кератиноцитов.
Изучение человеческих болезней, особенно неврологических и нейродегенеративных, была особенно сложной в связи с недоступностью адекватного человека клеточных моделях. Возможность перепрограммировать легко получить соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые кл…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Атаксия Фридрейха Research Alliance и пилот грант Арнольд Family Foundation и Центр стволовых клеток и биологии развития в MD Anderson Cancer Center.
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |