活细胞成像的移植细胞在一个三维矩阵表示荧光标记的蛋白质
Summary
传统的细胞过程，如细胞迁移研究二维的，僵硬的塑料表面上。本报告介绍了一个直接可视化蛋白定位和分析一个有关生理，立体矩阵的细胞迁移的蛋白质动力学的技术。
Abstract
传统上，细胞迁移进行了研究二维的，僵硬的塑料表面上。然而，在伤口愈合，组织再生和癌症转移，如重要的生物过程，细胞必须通过复杂的，立体化的细胞外组织的导航。为了更好地理解这些生物过程背后的机制，重要的是要研究负责驱动细胞迁移的蛋白质的作用。在这里，我们勾勒出一个协议研究使用的上皮细胞株（MDCK）细胞迁移的机制，和一个立体的，纤维，作为一个模型系统的自我聚合矩阵。这透明的细胞外基质是活细胞成像研究容易服从和更好地模拟生理，软组织环境。这份报告展示了一个直接可视化蛋白定位和动态的技术，和周围的三维矩阵变形。
考试蛋白定位在细胞过程的动态ination到蛋白质的功能提供了关键的洞察力。基因编码的荧光标记提供了一个独特的方法观察蛋白定位和动态。使用这种技术，我们可以分析细胞内积累的关键，强行通过基质细胞演习实时生成细胞骨架的组成部分。此外，使用多个不同波长的荧光标记，我们可以研究多种蛋白质同时进行本地化，从而让我们来测试，例如，不同的蛋白质是否具有类似或不同的角色。此外，荧光标记的蛋白质的动态，可量化的使用荧光漂白后（FRAP）分析恢复。这种测量方法检测蛋白的流动性和稳定约束的蛋白质是细胞骨架网络。
通过与蛋白质功能抑制剂治疗相结合的活细胞成像，我们可以检查实时的蛋白质和细胞迁移形态的分布变化。此外，我们还结合使用荧光示踪粒子矩阵内的嵌入式可视化在细胞迁移的矩阵变形的活细胞成像。因此，我们可以想像如何迁移细胞分布力产生的蛋白质，以及牵引力施加到周围基质。通过这些技术，我们可以得到宝贵的见解，成特定的蛋白质和他们的贡献细胞迁移机制的角色。
Protocol
Discussion
在这里，我们描述了一个用活细胞成像研究细胞迁移的机制，在一个三维矩阵的方法。这项技术的成功取决于获得“良好”的克隆稳定表达GFP标记的蛋白质。绿色荧光蛋白的水平低会损害细胞的健康，而过高GFP水平将有不良的副作用，对细胞需要一个多余的激励曝光。因此，转染到细胞中的基因的载体选择是很重要的（例如，子，荧光标记等）。有很多绿色荧光蛋白，包括红色荧光蛋白（RFP?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢手稿的关键读博士格兰特隅田川。这项工作是由一个贝克曼青年研究员奖“（SY），赫尔曼家庭新教师奖”（SY），美国国立卫生研究院尤里卡，加州大学癌症研究中心协调委员会的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
Referências
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, . A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O’Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).
- Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
