Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional
Summary
Processos celulares, tais como a migração das células têm sido tradicionalmente estudados em duas dimensões, superfícies de plástico duro. Este relatório descreve uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e análise dinâmica de proteínas em células migrando de uma forma mais fisiologicamente relevantes, matriz tridimensional.
Abstract
Tradicionalmente, a migração celular foi estudada em duas dimensões, superfícies de plástico duro. No entanto, durante processos biológicos importantes, tais como a cicatrização da ferida, regeneração de tecidos, e metástase de câncer, as células devem navegar através de complexas, tecido tridimensional extracelular. Para compreender melhor os mecanismos por trás desses processos biológicos, é importante examinar os papéis das proteínas responsáveis por dirigir a migração celular. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar os mecanismos de migração celular usando a linha de células epiteliais (MDCK), e uma imagem tridimensional, fibroso, matriz auto-polimerização como um sistema modelo. Esta matriz extracelular opticamente clara se adequa facilmente aos estudos em células vivas, de imagem e melhor imita o fisiológico, meio ambiente dos tecidos moles. Este relatório demonstra uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e dinâmica, e deformação das imediações matriz tridimensional.
Exameminação da localização de proteínas e dinâmica durante processos celulares fornece uma visão fundamental em funções da proteína. Geneticamente codificado marcas fluorescentes fornecem um método único para a observação de localização de proteínas e dinâmica. Usando esta técnica, podemos analisar o acúmulo subcelulares de-chave, a força de geração de componentes do citoesqueleto em tempo real como as manobras de células através da matriz. Além disso, utilizando várias marcas fluorescentes com diferentes comprimentos de onda, podemos examinar a localização de proteínas simultaneamente, permitindo-nos testar, por exemplo, se diferentes proteínas têm funções semelhantes ou divergentes. Além disso, a dinâmica das proteínas fluorescentes marcados pode ser quantificada usando a Recuperação Após Fotodegradação Fluorescente (FRAP) análise. Esta ensaios de medição da mobilidade de proteínas e como forma estável as proteínas são vinculados à rede do citoesqueleto.
Ao combinar live-célula de imagem com o tratamento dos inibidores da função da proteína,podemos examinar em tempo real as mudanças na distribuição de proteínas e morfologia das células migrando. Além disso, nós também combinar live-célula de imagem com o uso de partículas fluorescentes tracer incorporados dentro da matriz para visualizar a deformação da matriz durante a migração celular. Assim, podemos visualizar como uma célula migrar distribui força de geração de proteínas, e onde as forças de tração são exercidos com a matriz circundante. Através destas técnicas, podemos obter informações valiosas sobre os papéis de proteínas específicas e suas contribuições para os mecanismos de migração celular.
Protocol
Discussion
Aqui nós descrevemos um método para usar live-célula de imagem para estudar os mecanismos de migração celular em uma matriz tridimensional. O sucesso desta técnica depende da obtenção de "bom" clones estavelmente expressando proteínas GFP. O baixo nível de proteínas GFP requer uma exposição de excitação excessiva que compromete a saúde das células, enquanto o nível GFP muito alto vai ter efeitos colaterais indesejáveis na célula. Assim, a escolha do vetor de transfecção genes em cé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Grant Sumida para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Investigator Award Beckman Young (SY), uma família Hellman Award Faculdade Novo (SY), um EUREKA NIH, da Universidade da Califórnia Cancer Research Comissão Coordenadora.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
Referências
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