Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Summary

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Abstract

Tradicionalmente, la migración celular se ha estudiado en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Sin embargo, durante los procesos biológicos como la cicatrización de heridas, regeneración de tejidos y metástasis del cáncer, las células deben navegar a través de complejos de tres dimensiones del tejido extracelular. Para comprender mejor los mecanismos detrás de estos procesos biológicos, es importante examinar las funciones de las proteínas responsables de conducir la migración celular. Aquí, se describe un protocolo para estudiar los mecanismos de migración celular utilizando la línea de células epiteliales (MDCK), y en tres dimensiones, fibroso, la auto-polimerización de la matriz como un sistema modelo. Esta matriz extracelular ópticamente claro es fácilmente susceptible de estudios de imágenes de células vivas y una mejor imita el entorno fisiológico, los tejidos blandos. Este informe demuestra una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y la dinámica, y la deformación de los alrededores en tres dimensiones de la matriz.

Examenmen de localización de la proteína y la dinámica en los procesos celulares proporciona información clave en las funciones de las proteínas. Genéticamente codificados etiquetas fluorescentes proporcionan un método único para la observación de localización de la proteína y la dinámica. Usando esta técnica, podemos analizar la acumulación subcelular de la clave, la fuerza generadora de los componentes del citoesqueleto en tiempo real como las maniobras de la célula a través de la matriz. Además, el uso de múltiples etiquetas fluorescentes con diferentes longitudes de onda, podemos examinar la localización de las proteínas de forma simultánea, lo que nos permite poner a prueba, por ejemplo, si las diferentes proteínas tienen funciones similares o divergentes. Además, la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia se puede cuantificar el uso de recuperación después de photobleaching fluorescente (FRAP) el análisis. Esta medición de la movilidad de los ensayos de proteína y cómo de manera estable las proteínas están obligados a la red del citoesqueleto.

Mediante la combinación de imágenes de células vivas con el tratamiento de los inhibidores de la función de la proteína,podemos analizar en tiempo real los cambios en la distribución de las proteínas y la morfología de las células que migran. Además, también se combinan imágenes de células vivas con el uso de partículas de trazador fluorescente integrado dentro de la matriz para visualizar la deformación de la matriz durante la migración celular. Por lo tanto, podemos visualizar cómo una célula migrar distribuye la generación de la fuerza de las proteínas, y donde las fuerzas de tracción que se ejerce la matriz circundante. A través de estas técnicas, se puede obtener información valiosa sobre el papel de proteínas específicas y sus contribuciones a los mecanismos de migración celular.

Protocol

1. Generación de línea celular estable (por ejemplo, las células MDCK) Células de la placa a 80-90% de confluencia en una placa de p35. No permita que las células del 100% de monocapa, lo que reducirá la eficiencia de transfección. Transfectar las células con el plásmido de interés utilizando Lipofectamine 2000. Optimizar las condiciones de transfección utilizando el protocolo del fabricante. Al día siguiente, el paso de las células en dos p150 placas de Petri. El plato grande…

Discussion

Aquí se describe un método para el uso de células vivas de imagen para estudiar los mecanismos de migración de las células en una matriz tridimensional. El éxito de esta técnica depende de la obtención de "buenos" clones que expresan establemente GFP-etiquetados proteínas. El bajo nivel de las proteínas GFP requerirá una exposición excesiva excitación que compromete la salud de las células, mientras que el nivel demasiado alto, las buenas prácticas agrarias tienen efectos secundarios indeseables…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Collagen, bovine, Type I	BD Biosciences	354231	Stock is about 3 mg/ml
3-aminopropyltrimethoxysilane	Sigma Aldrich	281778	Dilute in water
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	340855	Dilute in PBS
1M Hepes	Invitrogen	15630-080
Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
Culture media components:
DMEM	Invitrogen	31600-034
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S115500
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Kanamycin	Invitrogen	15160-054