Live-cell imaging at migrere celler, der udtrykker fluorescens-mærkede Proteiner i en tre-dimensionel Matrix
Summary
Cellulære processer såsom celle migration er traditionelt blevet undersøgt på to-dimensionelle, stiv plast overflader. Denne rapport beskriver en teknik til direkte at visualisere protein lokalisering og analysere protein dynamik i celler vandrer ud i en mere fysiologisk relevante, tre-dimensionel matrix.
Abstract
Traditionelt har cellemigration blevet undersøgt på to-dimensionelle, stiv plast overflader. Men i vigtige biologiske processer som sårheling, vævsregeneration, og kræft metastase, må cellerne navigere gennem komplekse, tre-dimensionelle ekstracellulære væv. For bedre at forstå mekanismerne bag disse biologiske processer, er det vigtigt at undersøge rollerne for de proteiner, der er ansvarlig for kørsel celle migration. Her skitserer vi en protokol til at studere de mekanismer for celle migration ved hjælp af epitelcelle linje (MDCK), og en tre-dimensionel, fiberholdigt, self-polymerisering matrix som model system. Denne optisk klar ekstracellulære matrix er let modtagelig for live-cell imaging studier og bedre efterligner den fysiologiske, blødt væv miljø. Denne rapport viser en teknik til direkte at visualisere protein lokalisering og dynamik, og deformation af det omgivende tredimensionale matrix.
Eksamennering af protein lokalisering og dynamik i løbet af cellulære processer giver nøglen indsigt i protein funktioner. Genetisk kodet fluorescerende tags give en unik metode til at observere protein lokalisering og dynamik. Ved hjælp af denne teknik, kan vi analysere subcellulære ophobning af centrale, kraft-generering cytoskeletal komponenter i real-tid som cellen manøvrer gennem matrix. Hertil kommer, bruger flere fluorescerende tags med forskellige bølgelængder kan vi undersøge lokalisering af flere proteiner samtidigt, hvilket giver os mulighed for at teste, for eksempel om forskellige proteiner har lignende eller divergerende roller. Desuden kan dynamikken i fluorescens-mærkede proteiner skal kvantificeres med fluorescerende Recovery Efter fotoblegning (FRAP) analyse. Denne måling assays proteinet mobilitet, og hvordan stabilt bundet til proteiner er til cytoskeletal netværket.
Ved at kombinere live-cell imaging med behandlingen af protein funktion hæmmere,vi kan undersøge i real-time ændringer i fordelingen af proteiner og morfologi af trækkende celler. Desuden har vi også kombinere live-cell imaging med brug af fluorescerende sporstof partikler indlejret i den matrix, for at visualisere den matrix deformation celle migration. Således kan vi visualisere, hvordan en vandrende celle distribuerer kraft-genererende proteiner, og hvor trækkraft er, at kræfter til det omgivende matrix. Gennem disse teknikker, kan vi få værdifuld indsigt i de roller af specifikke proteiner og deres bidrag til de mekanismer af celle migration.
Protocol
Discussion
Her beskriver vi en metode til at bruge live-cell imaging at studere de mekanismer af celle migration i en tre-dimensionel matrix. Succesen med denne teknik er afhængig af at opnå "god" kloner stabilt udtrykker GFP-taggede proteiner. Det lave niveau for GFP proteiner vil kræve et overskud excitation eksponering, der kompromiser celle sundhed, mens for højt GFP niveau vil have uønskede bivirkninger på cellen. Således vektoren valg til transfect gener i celler er vigtig (f.eks initiativtageren, fluorescen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Grant Sumida til kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Beckman Young Investigator Award (SY), en Hellman Familie nyt fakultet Award (SY), en NIH EUREKA, University of California Cancer Research koordineringsudvalg.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
Referências
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, . A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O’Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).
- Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
