Live-ячейки изображения по переносу клеток, экспрессирующих флуоресцентно с метками Белки в трехмерной матрице
Summary
Клеточных процессов, таких как сотовые миграции традиционно изучался на двумерных, жесткие пластмассовые поверхности. В настоящем докладе описывается методика визуализации белка непосредственно локализации и анализа динамики белков в клетках, мигрирующих в физиологически более актуальной, трехмерные матрицы.
Abstract
Традиционно, миграции клеток изучалась на двумерных, жесткие пластмассовые поверхности. Тем не менее, во время важных биологических процессов, таких как заживление ран, регенерации тканей, метастазирования и рака, клетки должны ориентироваться в сложной, трехмерной внеклеточной ткани. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в этих биологических процессов, важно для изучения роли белков, ответственных за вождение миграции клеток. Здесь мы опишем протокол для изучения механизмов клеточной миграции с использованием эпителиальных клеточных линий (MDCK), и трехмерные, волокнистых, само-полимеризации матрицы в качестве модельной системы. Это оптически прозрачные внеклеточного матрикса легко поддаются живых клеток исследования изображений и лучше имитирует физиологическую, мягких тканей среды. Данный отчет демонстрирует технику для визуализации непосредственно локализации белка и динамики, и деформации окружающей трехмерной матрицы.
Экзаменination локализации белка и динамики в процессе клеточных процессов обеспечивает понимание ключевых белков функций. Генетически закодированный флуоресцентные метки обеспечивают уникальный метод для наблюдения локализации белка и динамики. Используя эту технику, мы можем проанализировать субклеточных накопления ключ, сила генерирующих компонентов цитоскелета, в режиме реального времени, как клетка маневров через матрицу. Кроме того, использование нескольких флуоресцентных меток с разными длинами волн, мы можем рассмотреть локализацию нескольких белков одновременно, что позволяет нам проверить, например, могут ли различные белки имеют сходные или различные роли. Кроме того, динамика флуоресцентно меткой белки могут быть количественно, используя флуоресцентные Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) анализа. Это измерение анализов подвижности белка и как стабильно связаны белки цитоскелета в сети.
Объединив жить-клеточной визуализации при лечении ингибиторами функции белка,мы можем рассмотреть в режиме реального времени изменения в распределении белков и морфологии мигрирующих клеток. Кроме того, мы и объединяем в живых клеток изображений с использованием флуоресцентных частиц трассирующими встроены в матрицу для визуализации матрицы деформации в процессе миграции клеток. Таким образом, мы можем представить себе, как мигрирующие ячейки распределяет силу генерирующих протеины, и где тяги силы оказываемого на окружающую матрицу. С помощью этих методов, мы можем получить ценную информацию о роли специфических белков и их вклад в механизмы клеточной миграции.
Protocol
Discussion
Здесь мы опишем метод с использованием живых клеток изображений для изучения механизмов миграции клеток в трехмерной матрице. Успех этого метода зависит от получения "хорошего" клонов стабильно выразить GFP с метками белков. Низкий уровень белков GFP потребуется чрезмерное воздейс…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Гранта Сумида за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Бекман премия для молодых следователь (SY), семьи Hellman Новая премия факультета (SY), NIH EUREKA, Калифорнийский университет онкологический научный координационный комитет.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
Referências
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, . A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O’Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).
- Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
