זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה
Summary
ויזואליזציה של כלי הכליליים הוא קריטי לקידום ההבנה שלנו של מחלות לב וכלי דם. כאן אנו מתארים שיטה המרוססת בכלי הדם הכליליים Murine עם גומי radiopaque סיליקון (Microfil), לקראת הדמיה ממוחשבת מיקרו (μCT) טומוגרפיה.
Abstract
הדמיה של כלי הדם הופך חשוב יותר ויותר מדינות רבות להבנת מחלות שונות. בעוד מספר טכניקות קיימות הדמיה בכלי הדם, מעטים מסוגלים לדמיין את רשת כלי הדם כולה תוך הרחבת פתרון הכולל 1,2 כלי קטן יותר. בנוסף, רבים טכניקות יציקה כלי הדם להרוס את הרקמה שמסביב, מונע ניתוח נוסף של המדגם 3-5. אחת השיטות אשר עוקף בעיות אלה הוא מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (μCT). μCT הדמיה יכול לסרוק ברזולוציות <10 מיקרון, הוא מסוגל לייצר שחזורים 3D של רשת כלי הדם, ומשאירה רקמות שלמות לצורך ניתוח מאוחר יותר (למשל, היסטולוגיה ו morphometry) 6-11. עם זאת, כלי הדמיה על ידי שיטות לשעבר ב vivo μCT דורש כלי להתמלא מתחם radiopaque. לפיכך, ייצוג מדויק של כלי הדם המיוצר על ידי μCT הדמיה מותניתמילוי אמינות מוחלטת של הכלים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה למילוי כלי עכבר הכליליים לקראת הדמיה μCT.
שתי טכניקות שולטים קיים למילוי בכלי הדם הכליליים: in vivo באמצעות טפטוף cannulation ו מדרדר של אבי העורקים (או סניף את קשת אבי העורקים) 12-14, או vivo לשעבר באמצעות מערכת טפטוף Langendorff 15-17. כאן אנו מתארים את שיטת אבי העורקים vivo cannulation אשר תוכנן במיוחד כדי להבטיח מילוי של כל כלי. אנו משתמשים צמיגות נמוכה radiopaque תרכובת בשם Microfil אשר יכול perfuse דרך כלי הקטנים ביותר כדי למלא את כל נימי הדם, כמו גם את שני הצדדים העורקים והוורידים של רשת כלי הדם. כלי הם perfused עם המאגר באמצעות מערכת טפטוף בלחץ, ומילא אחר כך עם Microfil. על מנת להבטיח Microfil הממלא את כלי הדם הקטנים עמידות גבוהה יותר, אנו ולקשור את הענפים הגדולים emanating מ אבי העורקים, אשר מסיט את Microfil אל מהתקפי. לאחר מילוי הושלמה, כדי למנוע את האופי האלסטי של רקמת לב מ לסחוט Microfil מתוך כלי מסוימים, אנו ולקשור נגישים הנקודות העיקריות ליציאה של כלי הדם מיד לאחר מילוי. לכן, הטכניקה שלנו מותאמת במיוחד עבור מילוי מלא ושימור מרבי של חומר מילוי, המאפשרת הדמיה של רשת שלמה של כלי הדם הכליליים – עורקי, נימי דם, וורידים כאחד.
Protocol
Discussion
רקמת לב יש דרישה מטבולית גבוהה מאוד, ולכן דורש אספקה קבועה של חומרי מזון וחמצן מהדם מועברים על ידי כלי הדם הכליליים. מחלות של כלי כלילית, אשר להפחית תפקוד כלילית עקב היצרות כלי וסתימת, יכול להוביל לחוסר חמצן לרקמות איסכמיה, ולשים חולים הנגועים בסיכון לאוטם שריר הלב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר קלי סטיבנס לניסויים הראשונים של פרוטוקול, ד"ר מיכאל סימונס, Hauch ד"ר קיפ, וחברי שתי המעבדות שלהם לדיון בכלל.
עבודה זו היא תמיכה על ידי NIH מענקים HL087513 ו P01 HL094374.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2″ x 2″ Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾” Angiocath IV catheter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½”gauge needles | Becton Dickinson | BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma | A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon | NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap | FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher | P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge, Overland Park, KS, USA | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | Flow Tech | MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus | 723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd Labs | NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
Referências
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. . Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
