Perfusione retrograda e riempimento del sistema vascolare coronarico mouse come preparazione per la Micro Computed Tomography Imaging

Summary

Visualizzazione dei vasi coronarici è fondamentale per avanzare la nostra comprensione delle malattie cardiovascolari. Qui si descrive un metodo per la perfusione vascolare coronarica murino con una gomma di silicone radiopaco (Microfil), in preparazione per le micro-Tomografia Computerizzata (μCT) imaging.

Abstract

Visualizzazione della vascolarizzazione sta diventando sempre più importante per capire molti stati patologici diversi. Mentre esistono diverse tecniche per l'imaging vascolare, pochi sono in grado di visualizzare la rete vascolare nel suo insieme, mentre si estende a una risoluzione che include il ^1,2 imbarcazioni più piccole. Inoltre, molte tecniche di fusione vascolari distruggere il tessuto circostante, impedendo ulteriori analisi del campione ^3-5. Un metodo che elude questi temi è micro-Tomografia Computerizzata (μCT). μCT possibile eseguire la scansione di immagini con risoluzione inferiore a 10 micron, è capace di produrre ricostruzioni 3D della rete vascolare, e lascia intatto il tessuto per l'analisi successiva (ad esempio, l'istologia e la morfometria) ^6-11. Tuttavia, navi imaging di ex vivo metodi μCT richiede che i vasi da riempire con un composto radiopaco. Come tale, la rappresentazione accurata di vasi prodotta da μCT immagini è subordinatoriempimento affidabile e completa dei vasi. In questo protocollo, si descrive una tecnica per il riempimento di vasi coronarici del mouse in preparazione per l'imaging μCT.

Due tecniche predominano esistono per il riempimento del sistema vascolare coronarico: in vivo via cannulazione e perfusione retrograda dell'aorta (o di un ramo dell'arco aortico) ^12-14, o ex vivo mediante un sistema di perfusione Langendorff ^15-17. Qui si descrive un metodo de cannulazione aortica vivo che è stato specificamente progettato per garantire il riempimento di tutte le navi. Usiamo un composto a bassa viscosità radiopaco chiamato Microfil che può perfondere attraverso i piccoli vasi per riempire tutti i capillari, nonché entrambi i lati arterioso e venoso della rete vascolare. Le navi sono perfusi con tampone utilizzando un sistema di pressione di perfusione, e poi riempito con Microfil. Per garantire che Microfil riempie i piccoli vasi di resistenza superiori, abbiamo legare i rami di grandi dimensioni emanating dall'aorta, che devia il Microfil nelle coronarie. Una volta che il riempimento è completata, per impedire la natura elastica del tessuto cardiaco da spremere fuori Microfil di alcuni vasi, si legare accessibili i punti importanti uscita vascolari immediatamente dopo il riempimento. Pertanto, la nostra tecnica è ottimizzato per il riempimento completo e la ritenzione massimo dell'agente di riempimento, permettendo la visualizzazione della completa rete vascolare coronarico -, capillari, arterie e vene simili.

Protocol

1. Preparativi prima di iniziare Riempire ciascun lato dell'apparecchio perfusione pressione con tampone Vasodilator (4 mg / L papaverina + 1 g / L adenosina in PBS) o 4% paraformaldeide (PFA) in PBS, rispettivamente. Preparare una siringa 1/2cc insulina (con una 29G permanentemente attaccato ½ "needle), riempiendolo con 0,1 ml di eparina 1:100 (stock 5000U/ml) e piegando l'ago ~ 120 gradi con il smussata. Do the stesso con una siringa da 1 ml (con 26G ½ "spillo) riempita con 0,3…

Discussion

Tessuto cardiaco ha una forte domanda metabolica, e richiede pertanto un costante rifornimento di sostanze nutritive e ossigeno dal sangue erogata dal sistema vascolare coronarico. Malattie dei vasi coronarici, che riducono la funzione a causa di stenosi coronarica nave e blocco, possono portare a ipossia tissutale e di ischemia, e mettere i pazienti affetti a rischio di infarto miocardico e danni irreparabili al muscolo cardiaco. Una migliore comprensione dello stato di malattia di questi vasi è necessario, e critico …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1 ml syringes	Becton Dickinson	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	Becton Dickinson	BD-309306
2″ x 2″ Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾” Angiocath IV catheter	Becton Dickinson	BD-381112
26G ½”gauge needles	Becton Dickinson	BD-305111
Adenosine	Sigma	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge, Overland Park, KS, USA	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	Flow Tech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd Labs	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline