Spatio-temporelle de manipulation de l'activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes
Summary
Procédé pour spatio-temporel de commande de l'activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l'irradiation permet l'activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.
Abstract
Régulation dynamique de la famille Rho guanosine triphosphatases petites GTPases) avec une précision spatio-temporelle est grande essentiels pour diverses fonctions cellulaires et des événements 1, 2. Leur nature spatio-temporelle dynamique a été révélé par la visualisation de leur activité et la localisation en 3 temps réel. Afin d'obtenir une meilleure compréhension de leurs rôles dans diverses fonctions cellulaires au niveau moléculaire, la prochaine étape devrait être la perturbation des activités de protéines à un endroit précis subcellulaire et le calendrier.
Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une méthode pour induite par la lumière, spatio-temporellement activation contrôlée de petites GTPases en combinant deux techniques: (1) rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et (2) une méthode de photo-mise en cage de la rapamycine. Avec l'utilisation de la rapamycine-FKBP-FRB médiation hétérodimérisation, nous avons développé une méthode pour rapidement inductible activation ou l'inactivation des petites GTPases including Rac 4, Cdc42 4, 4 RhoA et Ras 5, dans lequel la rapamycine induit la translocation de la FKBP-condensés, ou leurs GTPases activateurs, à la membrane plasmique, où FRB est ancré. Pour le couplage avec ce système hétérodimérisation, nous avons également développé un système de photo-mise en cage de la rapamycine analogues. Un composé photo-cage est une petite molécule dont l'activité est supprimée avec un groupe photoclivable protéger connu sous le nom d'un groupe de mise en cage. Pour supprimer l'activité hétérodimérisation complètement, nous avons conçu une rapamycine en cage qui est attaché à une macromolécule de telle sorte que le complexe résultant grande ne peut pas traverser la membrane plasmique, ce qui conduit à pratiquement aucune activité de fond comme une dimérisation chimique à l'intérieur des cellules 6. Figure 1 illustre un schéma de notre système. Avec la combinaison de ces deux systèmes, nous recrutés localement un activateur de Rac à la membrane plasmique sur une échelle de temps de quelques secondes et atteint induite par la lumière d'activation Rac à la subcellulaire level 6.
Protocol
Discussion
Nous avons décrit une technique qui emploie un roman composé en cage avec le système hétérodimérisation FKBP-FRB afin de manipuler Rho GTPase activité à un endroit précis sur une échelle subcellulaire de temps en secondes.
Il ya trois limites de l'approche actuelle. Tout d'abord, parce que la méthode est basée sur la prévention ou permettant la diffusion des dimérisation travers la membrane plasmique, l'emplacement cible cellulaire doit être la membrane plasmique o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le NIH financement de la recherche (DK090868 et GM092930 à TI). Il ya une attente de brevet sur un analogue de la rapamycine en cage.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
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