Метод пространственно-временной контроль деятельности малого ГТФ света описывается. Этот метод основан на рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и фото-останов системы. Оптимизация светового облучения позволяет пространственно-временном управлять активацией малых ГТФаз на субклеточном уровне.
Динамическое регулирование семьи Ро малого triphosphatases гуанозин (GTPases) с большой пространственно-временной точностью имеет важное значение для различных клеточных функций и мероприятий 1, 2. Их spatiotemporally динамичный характер был выявлен по визуализации их деятельности и локализации в реальном времени 3. Для того чтобы получить более глубокое понимание их роли в различных клеточных функций на молекулярном уровне, то следующим шагом должно быть возмущение белка деятельность в точном внутриклеточной локализации и времени.
Для достижения этой цели мы разработали метод светоиндуцированного, пространственно-временное контролируемое активации малых ГТФаз путем объединения двух методов: (1) рапамицин вызванных FKBP-FRB гетеродимеризации и (2) фото-останов метод рапамицина. С помощью рапамицина опосредованного FKBP-FRB гетеродимеризации, мы разработали метод быстрого индуцибельной активации или инактивации малых ГТФаз includiнг Rac 4, Cdc42 4 RhoA 4 и Рас-5, в котором рапамицин вызывает перемещение FKBP слившихся GTPases или их активаторов, к мембране, где ФРС на якорь. В связи с этим гетеродимеризации системы, мы также разработали фото-останов системы рапамицина аналогов. Фото-клетках соединение маленькие молекулы, чья деятельность подавляется с photocleavable защиты группы, известной как удерживание группы. Для подавления гетеродимеризации деятельность полностью, мы разработали в клетке рапамицина, которые привязаны к макромолекуле такие, что в результате большого комплекса не может пересечь плазматической мембраны, что приводит к практически без фоновой активности в качестве химического dimerizer внутри клеток 6. На рисунке 1 показана схема нашей системы. Благодаря сочетанию этих двух систем, мы набранных на местах Rac активатора плазматической мембраны на шкале времени в секундах и достигли светоиндуцированного Rac активации на субклеточном левэль-6.
Мы описали технику, которая использует новые соединения в клетках вместе с FKBP-FRB гетеродимеризации системы для того, чтобы манипулировать Rho ГТФ деятельность в точном внутриклеточной локализации на временной шкале в секундах.
Существуют три ограничения данного подхода…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано НИЗ финансирования научных исследований (DK090868 и GM092930 ТИ). Существует в ожидании патента на клетке рапамицин аналог.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
Avidin | Sigma | A9275-10MG |
DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.