Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen
Summary
Verfahren zum räumlichen-zeitlichen Steuerung der GTPase-Aktivität durch Licht beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und Foto einschließende Systeme. Optimierung der Licht-Bestrahlung ermöglicht die raum-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen auf subzellulärer Ebene.
Abstract
Dynamischen Regulation der Rho-Familie kleiner Guanosin Triphosphatasen (GTPasen) mit großer Präzision raumzeitlichen ist essentiell für verschiedene zelluläre Funktionen und Ereignisse 1, 2. Ihre raumzeitlich dynamische Natur wurde durch Visualisierung der ihre Aktivität und Lokalisierung in Echtzeit 3 enthüllt worden. Um ein tieferes Verständnis ihrer Rollen in diversen zellulären Funktionen auf molekularer Ebene zu gewinnen, sollte der nächste Schritt Störung der Protein-Aktivitäten sein, an einer präzisen subzelluläre Ort und Zeitpunkt.
(1) Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und (2) ein Foto einschließende Verfahren Rapamycin: Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir ein Verfahren zur lichtinduzierten, räumlich-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen durch Kombinieren von zwei Techniken entwickelt. Mit der Verwendung von Rapamycin-FKBP-vermittelte Heterodimerisierung FRB, haben wir ein Verfahren zur schnellen induzierbare Aktivierung oder Inaktivierung der kleinen GTPasen includi entwickeltng Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 und Ras 5, bei dem Rapamycin induziert Translokation von FKBP-kondensierten GTPasen, oder deren Aktivatoren, der Plasmamembran, wo FRB verankert ist. Für die Kopplung mit diesem Heterodimerisierung System haben wir auch ein Foto-Käfighaltung von Rapamycin-Analoga-System entwickelt. Ein Foto-caged Verbindung ist ein kleines Molekül, dessen Aktivität mit einem photospaltbaren Schutzgruppe als Käfighaltung Gruppe bekannt unterdrückt. Um Heterodimerisierung Aktivität vollständig zu unterdrücken, haben wir ein Käfig Rapamycin, die an ein Makromolekül, so dass die daraus resultierende große Komplex kann nicht über die Plasmamembran gebunden wird, was zu praktisch ohne Hintergrund-Aktivität als eine chemische Dimerisierer innerhalb der Zellen 6. Abbildung 1 zeigt ein Schema unserer System. Mit der Kombination dieser beiden Systeme haben wir vor Ort rekrutierten eine RAC-Aktivator zur Plasmamembran auf einer Zeitskala von Sekunden und erreicht durch Licht induzierten Rac-Aktivierung an der subzellulären levEL 6.
Protocol
Discussion
Wir beschrieben eine Technik, die eine neuartige Verbindung Käfigen beschäftigt zusammen mit dem FKBP-FRB Heterodimerisierung System, um Rho GTPase-Aktivität zu einem bestimmten subzellulären Ort auf einer Zeitskala von Sekunden zu manipulieren.
Es gibt drei Einschränkungen des vorliegenden Ansatzes. Erstens, weil das Verfahren zur Verhinderung oder die Diffusion von Dimerisierer über die Plasmamembran basiert, muss das Ziel zelluläre Lokalisation die Plasmamembran oder deren Umgebung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom NIH Forschungsförderung (DK090868 und GM092930 zu TI) unterstützt. Es gibt eine schwebende Patentanmeldungen auf einem Käfig Rapamycinanalog.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
Referências
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