Summary
טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.
Abstract
לאחר השחרור ל, דופמין המרווח הסינפטי מפעיל תכונות הביולוגיות שלו דרך יעדיה לפני ואחרי-הסינפטי 1. אות דופמין הוא הופסק על ידי דיפוזיה 2-3, אנזימים תאיים 4, ומובילים בממברנה 5. טרנספורטר דופאמין, הממוקם בחריץ שperi-הסינפטית של הנוירונים דופאמין מנקה את האמינים ישוחררו באמצעות שטף דופמין פנימה (ספיגה). טרנספורטר דופאמין יכול לעבוד גם בכיוון הפוך כדי לשחרר אמינים מבפנים החוצה בתהליך שנקרא תחבורה או זרימה של דופמין 5 כלפי חוץ. . יותר מ 20 שנים לפני זולצר et al דיווח טרנספורטר דופאמין יכול לפעול בשני מצבי פעילות: קדימה (ספיגה) והפוך (זרימה) 5. הנוירוטרנסמיטר משתחרר דרך הזרימה דרך טרנספורטר יכול להזיז כמות גדולה של דופמין למרחב החוץ התאי, והוכח לשחק תפקיד מרכזי בויסות דופמין h התאיomeostasis 6. כאן אנו מתארים כיצד מהדק תיקון זמני והקלטת amperometry יכולים לשמש למדידת דופמין שוחרר באמצעות מנגנון הזרימה עם רזולוצית זמן האלפית השנייה, כאשר פוטנציאל הממברנה נשלט. לשם כך, בהווה ובאותות חמצונים כל תאים (amperometric) נמדדים בו זמנית באמצעות מגבר 200B Axopatch (התקנים מולקולריים, עם סט נמוך לעבור Bessel מסנן ב1000 הרץ להקלטה נוכחית כל תאים). לamperometry הקלטת האלקטרודה סיבי פחמן מחובר למגבר שני (Axopatch 200B) וממוקמת בסמוך לממברנת הפלזמה ונערכה ב700 mV. הזרמים כל התא וחמצונים (amperometric) ניתן להקליט ויחסים נוכחי מתח יכולים להיות שנוצרו באמצעות פרוטוקול צעד מתח. בניגוד לכיול amperometric הרגיל, שדורש המרה לריכוז, הנוכחי הוא דיווח ישירות ללא התחשבות בנפח 7 היעילים. לפיכך, את הנתונים המתקבלמייצג גבול תחתון לזרימת דופאמין כי חלק המשדר הפסיד לפתרון התפזורת.
Protocol
1. ציוד ואספקה
- הר כלוב פאראדיי בחלק העליון של טבלת הרטט אנטי (TMI) כדי להקטין את רעש הרקע.
- המערכת בו זמנית תיקון מהדק amperometry ההקלטה דורשת מיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה DIC מצוין ועדשת מרחק עבודה ארוכה. חבר את המיקרוסקופ מגדלור לסוללה של מכונית. מקור אור זה DC עבור המערכת יהיה עוד יותר להקטין את הרעש החשמלי.
- micromanipulators ההידראולי (Siskiyou) רעש ירידה נוסף. בתצורה שלנו, אנו משתמשים בידי מניפולטור זכות להקלטת התא כולו, ונתן לשמאל amperometry.
2. הכן אלקטרודות להקלטה
- משוך אלקטרודות תיקון באמצעות pipettes קוורץ על חולץ P-2000 (סאטר). המשיכה שלנו נמשכת כ 5 שניות, עם שני מחזורי חום. זמן חום זה הביא התנגדות עקבית (3-4 MΩ) בpipettes תיקון התאים השלמים שלנו.
- מלא את האלקטרודה עםפתרון פיפטה המכיל דופמין 2 המ"מ ולהתקינה על מניפולטור הנכון. עטוף את המכל מחזיק פתרון פיפטה מכיל DA עם רדיד אלומיניום. שמור על קרח. דופמין הוא oxidizable. שמירה על הפתרון בקרח, מוגן מפני אור תקטין את שיעור החמצון של דופמין.
- בעדינות להסיר את האלקטרודה ProCFE (דגן) רעש נמוכה סיבי פחם amperometric מתיבת האחסון, למלא עם כספית, הר על מתאם amperometric (כמתואר באיור 1), ולאחר מכן לעלות על maniupulator הנכון. הגן על קצה סיב פחמן מניזק על ידי מחזיק בקצה המרוחק של סיבי הפחם. בדוק את האלקטרודה עם מיקרוסקופ מעבדה על מנת להבטיח את הקצה הוא נקי ושלם.
- בדוק את התקינות של האלקטרודה amperometric ידי לשים את האלקטרודה בצלחת פטרי תחתית כוס המכילה את הפתרון חיצוני. הקלט נוכחי בסיסית בהיעדר דופמין. הוסף 10 μl של פתרון DA 1mm למנה. מחדש האלקטרודה amperometric טובמייתרי גידול בזרם החמצונים. חזור על שלב זה בהתחלה ובסופו של כל ניסוי כדי לוודא את האלקטרודה amperometric עובדת כראוי.
3. הכן את התרבות העצבית הראשונית של נוירונים או תאי דופמין הונדסו טרנספורטר דופאמין בצלחות פטרי תחתית זכוכית
- לשטוף בעדינות את התאים או נוירונים הדופמין שלוש פעמים עם פתרון חיצוני חם.
- הר צלחת פטר תחתית הזכוכית על במת מיקרוסקופ.
4. דמיינו תא ולבצע את הניסוי
- מצא את נקודת המיקוד הנכונה בבירור לדמיין את התאים. הנח לחץ חיובי על האלקטרודה התיקון. ואז, בעדינות להביא את שתי אלקטרודות לתוך הפתרון, וקרוב לתא.
- מקם את האלקטרודה amperometric ליד התא (בצד שמאל), והאלקטרודה התיקון בצד ימין.
- להשיג חותם gigaohm בתא עם אלקטרודה התיקון. קרע החותם עם יניקהלהשיג תצורת תא כולו.
- אפשר 5-8 דקות לדיאליזה של פתרון פנימי המכיל דופמין לתא.
- השתמש צעד מתח רצוי או פרוטוקול רמפה. במקביל תרכשו נתונים משני פיפטה התיקון והאלקטרודה amperometric למדוד זרמי תא שלמים ולהפוך הובלה של דופאמין דרך טרנספורטר דופאמין בעוד פוטנציאל הקרום נשלט באמצעות פיפטה התיקון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מהדק תיקון משולב עם amperometry יכול למדוד DA זרימת 2A מתח תלוי DAT בתיווך. איור מציג תצורת נציג ניסיוני והקלטה של DA זרימת DAT בתיווך כאשר הסביבה התאית ופוטנציאל הקרום הם הדקו ע"י פיפטה תיקון כל תאים. באמצעות טכניקה זו, תאים לבטא חלבוני YFP-DAT הם מתח הדק עם פיפטה תיקון תא שלמה תוך האלקטרודה amperometric ממוקמת על קרום הפלזמה (איור 2 א). האלקטרודה התא כולו מתמלאת בפתרון פיפטה המכיל 2 המ"מ DA. האלקטרודה amperometric נוגעת קרום הפלזמה מתקיימת ב700 mV, פוטנציאל גדול יותר מפוטנציאל החיזור של התובע. זרמי DAT בתיווך (שלם בתאי איור 2C ו-amperometric איור 2D) נרשמים על ידי דריכת פיפטה כל התאים למתח קרום בין -60 ו100 mV מפוטנציאל החזקת mV -40 (האיור 2B האיור 2D) בזרמי amperometric מתאימה לשטף חיצוני של התובע. העברת סיבי פחמן מתיקון גורמת לתגובת החמצון להיות קטנים יותר ואיטי יותר. כצפוי לחמצון התובע, תגובת החמצון מופחת כאשר מתח סיבי הפחם מצטמצם 300 mV וייעלם לחלוטין על הפחתה נוספת. איור 2E-2F הם נציג של הקלטות קובלות ובלתי מקובלות. 2E האיור הוא דוגמה לGΩ הדוק חותם שלם תאים ולאות amperometric המקבילה. איור 2F היציגts תיקון דולף כל תאים. הקלטת amperometric המקבילה מודדת DA דלף.
איור 1. הכנה והרכבה של האלקטרודה amperometric. עדינות להסיר אלקטרודה ProCFE רעש נמוכה סיבי פחם amperometric מתיבת האחסון, למלא עם כספית. הכן את המתאם על ידי השחלת חוט הכסף לבעל מהדק התיקון, ולאחר מכן להשחיל את המתאם על בעל מהדק התיקון ועדינות לעלות את האלקטרודה amperometric. קצה סיב הפחם לא צריך לגעת בשום דבר.
איור 2. הקלטת תא שלם וamperometric נציג במתח מרובה כאשר פיפטה התיקון היא בתצורה כל התא. () קריקטורה הממחישה את התצורה הניסיונית.תאים לבטא טרנספורטר דופאמין מתח הדקו עם פיפטה תיקון כל תא ואילו האלקטרודה amperometric הוצבה בסמוך לממברנת התא. החמצון של התובע בתוצאות נוכחיות amperometric חיובי. (ב) איור של פרוטוקול גל מהדק מתח. (ג) זרמי DAT בתיווך נרשמו על ידי דריכת מתח הקרום בין -60 ו100 mV מפוטנציאל החזקת mV -40 עם פיפטה כל התאים. פתרון פיפטה הכיל דופמין mM 2, כפי שתואר לעיל 7-9. (ד) הנוכחי amperometric רכש במקביל לנוכחי כל התא ייצג בפנל C (לעיל). בתחילת שלב המתח, למתח גבוה מ 20 mV, הרשומות אלקטרודה amperometric חמצון נוכחי (חיובי) שעלו במהלך כל תקופת צעד המתח. (ה) (ו) הם נציג של ניסויים מהדקים מקובלים ולא מקובלים כל תא תיקון, בהתאמה. 2E האיור הוא דוגמה לGΩ w הדוקחותם חור תא ואת אות amperometric המקבילה. האיור 2F מייצג תיקון דולף כל תאים. התנגדות החותם הגיעה MΩ הטווח במקום GΩ לפני או אחרי הפריצה לתא כדי להשיג מצב כל תאים. הקלטת amperomtric המקבילה מודדת DA דלף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתח מהדק וamperometry סימולטני מציעים את היתרונות הבאים. כל סוגי התאים נגישים וניתן להשתמש בו להקלטה. זיהוי של תאים או נוירונים בי את ההקלטות נעשות הוא פשוט וברור. בפרט, אם התא מסומן fluorescently ידי הוספת תג ניאון לחלבון של עניין הנסיין יכול לבחור בקלות לתא המטרה או תא העצב. התצורה הניסיונית מאפשרת משלוח אחיד ומבוקר של סוכנים תרופתיים או באמצעות פיפטה התיקון, או על ידי תוספת של חומרים אלה לפתרון האמבטיה 10. טכניקת amperometry מהדק התיקון הזמנית מאפשרת חקירה של התפקיד של ערוצים שונים ומובילים בשחרורו של משדר oxidizable עם רזולוצית זמן האלפית השנייה תוך הקרום הפוטנציאל נשלט. אותו המידע שלא ניתן להשיג באמצעות שיטות הביוכימיות 8. אחד ההיבטים הייחודיים של approac זהח הוא שהיא מאפשרת מניפולציה של הסביבה התאית על ידי דיאליזה באמצעות תיקון פיפטה 7,11. עם זאת, טכניקה זו יש חסרון שאלקטרודה amperometric יכולה לזהות רק משדרי oxidizable. בנוסף, הרגישות של האלקטרודה amperometric פוחתת בנוכחות שחרור משמעותי הבזליים, ספונטני של מתחם oxidizable, ולכן מדידה של השחרור אחרי, למשל, טעינה מוקדמת של מתחם oxidizable שמשתחרר באופן ספונטני יכולה לייצר ירידה ב חמצונים נוכחיים. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא הדרישה של מומחיות טכנית וציוד יקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר Sanika Chirwa לסקירה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (DA026947, DA021471, וNS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
