المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات
Summary
وقد وضعنا برنامجا ميكروأري عالية الكثافة التي تتألف من 3D نانو الأغشية الحيوية من<em> C. المبيضة البيضاء</em> دعا<em> كاليفورنيا</em> BChip. ملف حساسية من الأدوية اختبار على<em> كاليفورنيا</em> BChip هو مشابه للنموذج التقليدي لوحة 96-جيد، مما يوحي بأن يعتبر مثاليا للرقاقة الفطرية للفحص عالية الإنتاجية الحقيقية من الأدوية المضادة للفطريات.
Abstract
المبيضات البيض يبقى العامل الرئيسي المسبب لداء المبيضات، والتي تمثل في الوقت الراهن رابع أكثر شيوعا عدوى المستشفيات مجرى الدم في مستشفيات الولايات المتحدة 1. هذه العدوى الانتهازية تشكل تهديدا متزايدا بالنسبة لعدد متزايد من الأفراد للخطر، وتحمل معدلات وفيات مرتفعة بشكل غير مقبول. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ترسانة محدودة من الأدوية المضادة للفطريات، ولكن أيضا إلى ظهور مقاومة ضد وكلاء ومضاد للفطريات الأكثر شيوعا. يزيد من تعقيد العلاج هو حقيقة أن ترتبط غالبية مظاهر المبيضات مع تشكيل الأغشية الحيوية، وخلايا داخل هذه الأغشية الحيوية تظهر زيادة مستويات المقاومة للمضادات الفطور معظم سريريا المستخدمة 2. نحن هنا وصف وضع ميكروأري عالية الكثافة التي تتكون من C. المبيضة البيضاء نانو الأغشية الحيوية، والتي قمنا اسمه كا BChip 3. لفترة وجيزة، يتم استخدام microarrayer الروبوتية تيس خلايا الخميرة الطباعة من C. المبيضة البيضاء على ركيزة صلبة. أثناء الطباعة، يتم تضمين خلايا الخميرة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام حجم ما يصل الى 50 NL ويجمد على ركيزة الزجاج بطلاء مناسب. بعد الطباعة الأولية، وحضنت الشرائح على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للتنمية بيوفيلم. خلال هذه الفترة بقع تنمو لتصبح كاملة النمو "نانو الأغشية الحيوية" الذي عرض نموذجي الخصائص الهيكلية والمظهري المرتبطة جيم ناضجة المبيضة البيضاء الأغشية الحيوية (أي تعقيد الصرفية، وثلاثة الأبعاد والهندسة المعمارية المقاومة للأدوية) 4. وبشكل عام، يتكون BChip الكالسيوم من الأغشية الحيوية ما يعادل 750 ~ ومميزة مكانيا، مع ميزة إضافية التي يمكن طباعتها رقائق متعددة ومعالجتها في وقت واحد. ويقدر بقاء الخلية عن طريق قياس كثافة فلوري من FUN1 التمثيل الغذائي وصمة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري. يعتبر مثاليا هذه الشريحة الفطرية لأجلك ..سراج الدين في الفرز الفائق الإنتاجية الحقيقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفطريات. بالمقارنة مع المعايير الحالية (أي لوحة microtiter 96-جيدا نموذج من تشكيل بيوفيلم 5)، والمزايا الرئيسية للرقاقة بيوفيلم الفطرية والتشغيل الآلي، والتصغير، وفورات في حجم وتكاليف الكواشف ووقت التحليلات، فضلا عن القضاء على عمل خطوات مكثفة. ونحن نعتقد أن مثل هذه رقاقة تسريع كبيرة في اكتشاف دواء مضاد للفطريات عملية.
Protocol
Discussion
وقد وضعنا خلية مقرها عالية الكثافة ميكروأري]، كاليفورنيا BChip، ويتألف من وحدات التخزين نانولتر من الأغشية الحيوية المبيضات البيض. تم طباعة ميكروأري على تعديل ركائز الزجاج، والذي سمح لمرفق قوي من بقع جل الكولاجين في الوقت الذي توفر hydrophobicity اللازمة للمادة هل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من إدارة تقنية جنوب ولاية تكساس (POCrr 2009.041)، ومعهد للتكامل الطب والعلوم من المركز الوطني للبحوث الموارد (UL 1RR025767)، و من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
Referências
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
