Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino
Summary
Abbiamo sviluppato una piattaforma ad alta densità microarray costituito da nano-3D di biofilm<em> C. albicans</em> Chiamato<em> Ca</em> BChip. Il profilo suscettibilità di farmaci testati su una<em> Ca</em> BChip è paragonabile a quello tradizionale a 96 pozzetti modello di piastra, suggerendo che il chip funghi è ideale per una vera high-throughput screening di farmaci antifungini.
Abstract
Candida albicans rimane il principale agente eziologico della candidosi, che attualmente rappresenta la quarta più comune infezione nosocomiale sangue negli ospedali degli Stati Uniti 1. Queste infezioni opportunistiche rappresentano una crescente minaccia per un numero crescente di individui compromessi, e portare i tassi di mortalità eccessivamente elevati. Ciò è in parte dovuto al limitato arsenale di farmaci antifungini, ma anche alla comparsa di resistenza agli agenti antifungini più comunemente usati. A complicare ulteriormente trattamento è il fatto che una maggioranza di manifestazioni di candidosi sono associati con la formazione di biofilm, e le cellule all'interno di questi biofilm mostrano livelli aumentati di resistenza agli clinicamente più utilizzati agenti antifungini 2. Qui si descrive lo sviluppo di una alta densità microarray che consiste di C. albicans nano-biofilm, che abbiamo chiamato Ca BChip 3. Brevemente, un micro-distributore robotico viene utilizzato to lievito cellule stampa di C. albicans su una substrato solido. Durante la stampa, le cellule di lievito sono racchiusi in una matrice tridimensionale usando un volume basso quanto 50 nL e immobilizzato su un substrato di vetro con un idoneo rivestimento. Dopo la stampa iniziale, le diapositive vengono incubate a 37 ° C per 24 ore per consentire per sviluppo biofilm. Durante questo periodo le macchie crescere in pienamente sviluppati "nano-biofilm" che visualizzare tipici caratteristiche strutturali e fenotipica associati con mature C. albicans biofilm (complessità vale a dire morfologica, tre l'architettura dimensionale e resistenza ai farmaci) 4. Complessivamente, il BChip Ca è composto di ~ 750 biofilm equivalenti e spazialmente distinto; con il vantaggio supplementari che chip multipli può essere stampato e elaborati contemporaneamente. La vitalità cellulare è stimato misurando l'intensità fluorescente di FUN1 metabolica macchia utilizzando un scanner microarray. Questo chip fungina è l'ideale per use in vero high-throughput screening per la scoperta di nuovi farmaci antifungini. Rispetto agli standard attuali (cioè il 96-well modello piastra microtitolo della formazione di biofilm 5), i principali vantaggi del chip biofilm fungine sono automazione, miniaturizzazione, risparmi nei costi e quantità dei reagenti e dei tempi di analisi, nonché l'eliminazione di lavoro operazioni intensive. Noi crediamo che il chip in modo significativo ad accelerare il processo di scoperta di nuovi farmaci antifungini.
Protocol
Discussion
Abbiamo sviluppato un cell-based ad alta densità microarray, Ca BChip, costituito da volumi nanolitri biofilm di Candida albicans. Il microarray è stata stampata su substrati di vetro modificato, che ha consentito per il fissaggio solido di spot gel di collagene, fornendo idrofobicità necessaria per un non-diffusione, gel emisferica 3D. Un singolo Ca BChip può sostituire circa otto piastre a 96 pozzetti, e chip diversi possono essere stampati e trattati allo stesso tempo. Il chip utilizza …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte da finanziamenti della Texas South Management Technology (POCrr 2009,041), l'Istituto per l'integrazione di Medicina e Scienza dal Centro Risorse Nazionale per la Ricerca (UL 1RR025767), e dal National Institute of Dental Research & craniofacciale ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
Referências
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