Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico
Summary
Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes de<em> C. albicans</em> Chamada<em> Ca</em> BChip. O perfil de susceptibilidade de drogas testadas em um<em> Ca</em> BChip é comparável com o modelo de placa convencional de 96 poços, sugerindo que o chip fúngica é idealmente adequado para o rastreio de alto rendimento real de drogas antifúngicas.
Abstract
Candida albicans continua a ser o principal agente etiológico da candidíase, que atualmente representa a infecção da corrente sangüínea quarta nosocomial mais comum em hospitais dos Estados Unidos 1. Estas infecções oportunistas são uma ameaça crescente para um número crescente de indivíduos comprometidos, e levar as taxas de mortalidade inaceitavelmente elevados. Isto é em parte devido ao arsenal limitado de drogas antifúngicas, mas também para o aparecimento de resistência contra os agentes mais utilizados antifúngicos. Para complicar ainda mais o tratamento é o facto de que uma maioria das manifestações de candidíase estão associados com a formação de biofilmes, e as células dentro destas biofilmes mostrar aumento dos níveis de resistência à maioria clinicamente utilizados agentes antifúngicos 2. Descrevemos aqui o desenvolvimento de uma micromatriz de alta densidade, que consiste de C. albicans nano-biofilmes, o que temos chamado Ca BChip 3. Resumidamente, um microarrayer robótico é utilizado tO impressão células de levedura de C. albicans sobre um substrato sólido. Durante a impressão, as células de levedura são colocadas em uma matriz tridimensional usando um volume tão baixo como 50 nL e imobilizada sobre um substrato de vidro com um revestimento adequado. Após a impressão inicial, as lâminas são incubadas a 37 ° C durante 24 horas para permitir a formação do biofilme. Durante este período, as manchas crescem em plenamente desenvolvidos "nano-biofilmes" que exibem características típicas estruturais e fenotípicos associados C. maduro albicans biofilmes (ie complexidade morfológica, três arquitetura dimensional e resistência às drogas) 4. Em geral, a BChip Ca é composto de ~ 750 biofilmes equivalentes e espacialmente distinto; com a vantagem adicional de que múltiplos chips podem ser impressos e processados simultaneamente. A viabilidade celular é estimada pela medição da intensidade de fluorescência de fun1 metabólica mancha usando um scanner microarray. Este chip de fungos é ideal para usi na triagem de alto rendimento verdadeiro para a descoberta de drogas anti-fúngico. Em comparação com as normas em vigor (isto é, a de 96 poços modelo placa de microtitulação de biofilme formação 5), as principais vantagens do chip biofilme fúngica são automação, a miniaturização, a poupança em quantidade e custo dos reagentes e análises em tempo, bem como a eliminação do trabalho passos intensivos. Acreditamos que tais chips irá acelerar significativamente o processo de descoberta de drogas antifúngicas.
Protocol
Discussion
Nós desenvolvemos uma célula baseado microarray de alta densidade, Ca BChip, consistindo em volumes nanolitros de biofilmes de Candida albicans. O microarray foi impresso em substratos de vidro modificado, o que permitiu a fixação robusta de pontos de gel de colágeno, proporcionando hidrofobicidade necessário para um não-divulgação, gel hemisférica 3D. Um único Ca BChip pode substituir cerca de oito placas de 96 alvéolos, e vários chips podem ser impressos e processado, ao mesmo t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por doações do Sul do Texas Technology Management (POCrr 2009,041), o Instituto para a Integração de Medicina e Ciência do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (UL 1RR025767), e do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
Referências
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
