Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков
Summary
Мы разработали высокой плотности микрочипов платформа, состоящая из 3D нано-биопленки из<em> С. Albicans</em> Называется<em> Ca</em> BChip. Восприимчивость профиля протестированы на наркотики<em> Ca</em> BChip сравнимо с обычным 96-луночного планшета модели, что свидетельствует о грибковой чип идеально подходит для истинных высокопроизводительного скрининга противогрибковых препаратов.
Abstract
Candida Albicans остается основным этиологическим агентом кандидоз, который в настоящее время является четвертым наиболее распространенных внутрибольничных инфекций кровотока в больницах США 1. Эти оппортунистические инфекции представляют собой растущую угрозу для все большего числа зараженных людей, и нести неприемлемо высокой смертности. Отчасти это связано с ограниченным арсеналом противогрибковые препараты, но и к появлению устойчивости к наиболее часто используемым противогрибковые препараты. Еще больше осложняет лечение является тот факт, что большинство проявления кандидоза, связанные с образованием биопленок, а клетки в этих биопленки показывают повышение уровня устойчивости к наиболее клинически использовать противогрибковые препараты 2. Здесь мы описываем развитие высокой плотности микрочипов, которая состоит из C. Albicans нано-биопленки, которые мы назвали Ca BChip 3. Короче говоря, робот microarrayer используется то печати дрожжевых клеток C. Albicans на твердую подложку. Во время печати, дрожжевые клетки заключены в трехмерную матрицу, используя объем всего 50 нл и иммобилизованных на стеклянную подложку с подходящим покрытием. После первоначальной печати, слайды инкубируют при 37 ° C в течение 24 часов, чтобы обеспечить развитие биопленки. В этот период пятна превращаются в полностью разработан "нано-биопленки", которые отображают типичные структурные и фенотипические характеристики, связанные со зрелыми C. Albicans биопленки (т.е. морфологической сложности, трехмерная архитектура и лекарственная устойчивость) 4. В целом, Ca BChip состоит из ~ 750 эквивалентны и пространственно различных биопленок, с дополнительным преимуществом, что несколько чипов могут быть распечатаны и обрабатываются одновременно. Жизнеспособность клеток оценивается путем измерения интенсивности флуоресценции от fun1 метаболических пятно с помощью сканера микрочипов. Это грибковое чип идеально подходит для итаковой в истинном высокопроизводительного скрининга для противогрибковых лекарств. По сравнению с действующими стандартами (например, 96-а планшет модель биопленки 5), основные преимущества грибковых чип биопленки являются автоматизация, миниатюризация, экономия на количестве и стоимости реагентов и анализ времени, а также ликвидация труда интенсивные шаги. Мы считаем, что такой чип позволит значительно ускорить процесс противогрибковые лекарств.
Protocol
Discussion
Мы создали ячейку на основе высокой плотности микрочипов, Ca BChip, состоящий из nanoliter объемы Candida Albicans биопленки. Микрочипов был напечатан на изменения стеклянные подложки, что позволило надежных вложений пятен коллагеновый гель, обеспечивая при этом необходимую для гидрофобно?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично финансируется за счет субсидий из Южного Техаса Management Technology (POCrr 2009,041), Институт интеграции медицины и наук из Национального центра по изучению ресурсов (UL 1RR025767), а также из Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
Referências
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
