Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Published: August 13, 2012 doi: 10.3791/4091
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

Summary

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler açıklanır

Abstract

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), öncelikle epitel hücrelerinin apikal hücre zarlarında bulunan bir klor kanalı, 1-3 transepitelyal sıvı dengesinin önemli bir rol oynar. Kistik fibrozis (CF) 4 ve sekretuar ishal 5: CFTR iki önemli hastalıklarla ilişkisi olmuştur. CF, CFTR Cl-kanalının sentez ya da işlevsel aktivitesini azalır. Bu hastalık Amerika Birleşik Devletleri'nde 2500 Kafkasyalılar 6 yaklaşık 1 etkiler. Aşırı CFTR etkinliği de cAMP veya bağırsak 7 cGMP üretimini uyarır toksin kaynaklı sekretuar ishal (örneğin, kolera toksini ve ısıya dayanıklı enterotoksin tarafından E. coli) durumlarında ortaya konmuştur.

Biriken deliller CFTR ve taşıyıcılar, iyon kanalları, reseptörler, kinazlar, fosfatazlar, sinyal dahil olmak üzere diğer proteinler giderek artan sayıda, arasındaki fiziksel ve fonksiyonel etkileşimlerin varlığını aklaING molekülleri ve sitoskeletal elemanları ve CFTR ve bağlayıcı protein arasındaki bu etkileşimlerin kritik in vitro ve in vivo da 8-19 CFTR-aracılı transepitelyal iyon taşıma düzenleyen dahil edilmesi gösterilmiştir. Bu protokol, biz sadece yöntemleri üzerinde durulacak bir protein bağlayan bir motif sahip CFTR karboksil terminal kuyruk arasındaki etkileşimlerin çalışmada yardım ve [motifi PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) olarak anılacaktır] Belirli bir bağlayıcı modülü ihtiva iskelesi proteinlerin grubu PDZ etki olarak anılacaktır. Şimdiye kadar, birkaç farklı PDZ iskele proteinler gibi NHERF1 gibi çeşitli akrabalıklar, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR ilişkili ligand), Shank2 ile CFTR karboksil terminal kuyruk bağlamak ve 20-27 ÇIKAN bildirilmiştir. PDZ iskele proteinler tarafından tanınır CFTR içinde PDZ motifi C terminus (yani, insan KFTR 1477-DTRL-1480) 20 son dört amino asitler olduğu. İlginç bir şekilde,CFTR akrabalıklar 22 farklı da olsa, NHERFs ve PDZK1 hem birden fazla PDZ alanı bağlayabilirsiniz. CFTR bağlayıcı bakımından Bu çok-değerliğine PDZ iskelesi proteinleri hücreleri 16-18 seçici / spesifik ve verimli bir sinyalleşme için kompleksleri sinyalleşme CFTR makromoleküler oluşumunu kolaylaştıran olabileceğini düşündürmektedir işlevsel bir öneme sahip olduğu gösterilmiştir.

Çoklu biyokimyasal testler incelemek için geliştirilmiştir CFTR-içeren bu işbirliğinin immünopresipitasyon, açılan tayini, çifti-bilge birleştirme testi, kolorimetrik çifti-bilge birleştirme testi ve makromoleküler karmaşık bir montaj test 16-19,28,29 gibi protein etkileşimleri, . Burada protein-protein ya da CFTR 16-19,28,29 içeren etki alanı etki alanı etkileşimlerini incelemek için laboratuvar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır in vitro, karmaşık bir PDZ motifi bağımlı CFTR içeren makromoleküler montaj ayrıntılı yordamlar odaklanın.

Protocol

1. Bakterilerde Rekombinant Takip edilen Fusion Proteinlerin İfade ve Arıtma

  1. CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR ve NHERFs (tam boy veya PDZ1 ya PDZ2 etki için C-kuyrukları (C-terminusta PDZ motifleri ihtiva eden son 50-100 amino asitleri) ile tanımlanan bölgeler amplifiye ) PCR yaklaşım.
  2. GST-füzyon proteinleri için pGEX4T-1 vektör (örneğin GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), MBP-füzyon proteinleri için pMAL-C2 vektör (örneğin MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT içine PCR ürünleri Clone ), ve His-S-füzyon proteinleri (örneğin, His-S-CFTR CT olarak, His-S-PDZK1) için pET30.
  3. Bir proteaz eksikliği E. Transform coli suşu (BL21-de3) olası rekombinant protein yıkımı en aza indirmek için.
  4. Uygun antibiyotikler (örneğin, ampisilin, kanamisin veya gibi) içeren Luria-Bertani ortamı (pH 7.0) içinde 37 ° C de bir gece kültüre büyür. 1:10 gece kültürü seyreltilir ve 37 başka bir 2 saat için büyümek ° C Içinde0,5-1 m M 30 ° C'de 4 saat süreyle sonraki IPTG ile Duce 8000 santrifüj ile pelet hücreleri x g 10 dakika süre ile 4 ° C.
  5. (50 m M Tris-HCl, pH 8.0, 1 m M EDTA, 1 M m PMSF, ve% 10 sukroz) lizozim (1 mg / mL),% 0.2 Triton X-100 ve proteaz ihtiva eden tampon çözeltisi içinde, sakaroz hücrelerini Lyse inhibitörleri. Hücre topağı kültür 1 L kaynaklanan için 20 mL kullanabilir.
  6. 4 ° C'de 30 dakika süre ile, bir döner çalkalayıcıda, karıştırın
  7. 4 ° C'de 30 dakika süreyle 20,000 x g'de Spin Supernatan toplayın.
  8. Üstte yüzen berrak madde içinde, aşağıdaki reçine / agaroz boncukları (sükroz tampon çözeltisi içinde% 50 bulamaç) 1 ml:
    • GST füzyon proteinleri Glutatyon agaroz boncuk.
    • Onun-S füzyon proteinleri için Talon boncuk.
    • MBP füzyon proteinleri için Amiloz reçine.
  9. 4 de 4 saat süreyle karışımı ° döner çalkalayıcıda, C.
  10. 2 mi için karıştırılması, 1x PBS (15 mL) içinde resuspending ile yıkanır boncuklarn, 800 eğirme × g 2 dk ve atarak supernatant için. Altı kere için bu adımı yineleyin.
  11. İlgili elüsyon tamponuyla (boncuklar 1 mL başına 2 mL elüsyon tamponuyla) kullanılarak boncuklar proteini elüt edilmesi.
    • GST füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 25 m M Tris-HCl (pH 8.0), 140 m M NaCl, 20 ve m M glutation azaltılabilir.
    • His füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 20 m M Tris-HCl (pH 8.0), 500 m M NaCl ve 200 m M imidazol.
    • MBP füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 20 m M Tris-HCl (pH 8.0), 200 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M DTT ve 10 m M maltoz.
  12. 4 azından 1x PBS 2 L karşı Elüsyonlanan protein Dialyze ° C (mümkün proteini düşüşü önlemek üzere). PBS dört kez 4 saatte değiştirin. -80 Düzeyinde küçük hacimde bir Centricon filtresi (10,000 MW kesim, Millipore) ve mağaza kullanarak proteini konsantresi ° C
  13. DetBradford yöntemiyle protein konsantrasyonu ermin. SDS-PAGE standartlar olarak BSA kullanarak protein kalitesini değerlendirin. Proteinin bütünlüğü tatminkar değil ise, bu tür jel filtrasyonu ya da iyon değişimi gibi ikincil saflaştırma işlemleri de kullanılabilir. (Örneğin, biz daha GST-füzyon proteini arındırmak için bir G-75 sepharose kolon kullanılmıştır).

2. Hücre Kültürü ve Hücre Lysate Hazırlık

  1. Kültür bebek Hamster böbrek (BHK) hücreleri stabil aşırı ekspres CFTR-wt ve CFTR-his10 veya BHK hücrelerinde geçici aşırı ekspres Bayrak-LPA 2-wt veya Bayrak-LPA 2-ΔSTL ve Madin-Darby canine böbrek (MDCK Eagle minimum gerekli ortamda stabil bir şekilde aşırı ifade MRP2 (MEM)% 5 CO2 ile 37 az% 10 fetal dana serumu ve penisilin / streptomisin polistiren şişeler içerisinde ° C ihtiva eden) hücre.
  2. Kültür insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri stabil aşırı ekspres CFTR-wt ve Dulbecco CFTR-his10'% 5 CO2 ile 37 ° C'de% 10 fetal bovin serumu ve penisilin / streptomisin polistiren şişeler içinde ilave s değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM).
  3. Kullanımı; - (% 0.2 Triton X-100-1 m M phenylmethylsulphonyl flor, 1 ug / mL aprotinin, 1 ug / ml löpeptin, 1 ug / ml pepstatin içeren proteaz inhibitörleri oluşan bir karışım ile desteklenmiş PBS) Lysis Buffer hücrelerin Lyse Her 60 mm petri ve her 100 mm petri için 1000 uL lizis tamponu için 500 uL lizis tamponu.
  4. Hücre ° C, ve 4 de 15 dakika boyunca 16.000 santrifüj ile erimeyen madde x g kaldırmak ° C'de 4 azından 20 dakika boyunca sallayın lizatları Bradford testi ile protein konsantrasyonu belirler.

3. Bir CFTR içeren makromoleküler Kompleksi İn Vitro Kurulu'nda (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. Lizis tampon 200 ul (PBS -% 0.2 Triton X-100 + proteaz inhibitörleri) içine, 20 mikrogram arıtılmış GST-MRP4-C terminali ekleyin50 aa (CT50) füzyon proteini.
  2. Onun-S-PDZK1 füzyon proteini arıtılmış çeşitli miktarlarda (0-40 mg) ekleyin.
  3. 22 ° C'de 1-2 saat için bir döner mikser üzerinde iki protein karıştırılır.
  4. Protein karışımı içine 20 uL glutation boncuklar (50% bulamaç) eklenir, ve başka bir 1 saat boyunca karıştırmaya devam edin. Bu aşama, aynı zamanda çift-akıllı bağlanma olarak ifade edilir.
  5. Bu süre esnasında, HEK293 hücre lizatları hazırlanması yukarıda adım 2'de açıklandığı gibi olarak artmış bayrak-CFTR (wt)).
  6. Lizis tamponu ile iki kez karmaşık yıkayın. Her yıkama için 1 dakika için 800 × g Spin ve dikkatle her yıkamadan sonra süpernatant aspire. Alt boncuk emmek için dikkatli kullanın.
  7. Boncuklara yukarıda hazırlanmış HEK293 hücre lizatları ekleyin ve yavaşça 3 saat (ya da gece boyunca) için 4 ° C'de karıştırılır.
  8. Adım boncuklar 3.6) içinde tarif edildiği gibi lizis tamponu ile yaygın üç kez yıkanır.
  9. 30 uL numune tamponu (5 x) kullanılarak proteinleri elüt edilmesi: 0.6 M Tris-HCl (pH 6.8),% 50 gliserol,% 2 SDS, ve% 0.1 mavi Bromofenol; içeren% 5 β-merkaptoetanol.
  10. 5.000 az 10-15 dakika ve spin ° C su banyosunda × g 30 s için boncuk çöktürmek için 37 inkübe edin.
  11. 4-15% jel üzerine tüm eluat yükleyin.
  12. 30-40 dakika için SDS-PAGE çalıştırın.
  13. 1.5 saat için, PVDF membran protein bantları aktarın.
  14. % 5 yağsız süt ihtiva eden olmayan TBS-Tween içindeki membran bloke eder.
  15. 4 azından primer antikor (anti-IgG CFTR, R1104 gibi) ile membran ° C, bir gece boyunca inkübe edilir.
  16. 5 dk, altı kez TBS-Tween ile membran yıkanır.
  17. 22 ° C'de 45 dakika süreyle sekonder antikor (örneğin, keçi anti-fare HRP bağlı 2. antikoru gibi) ile inkübe membran
  18. 5 dk, altı kez TBS-Tween ile membran yıkanır.
  19. ECL yoluyla protein bantları gözünüzde canlandırın.
  20. Temsilci veriler Şekil 1'de gösterilmiştir.
jove_title "> 4. Temsilcisi Sonuçlar

In vitro olarak monte edilmiştir CFTR-içeren makromoleküler sinyalleşme karmaşık bir örnek Şekil 1 'de gösterilmiştir. A makromoleküler kompleksi MRP4 C-terminal 50 amino asitleri (MRP4-CT50), PDZK1, ve tam uzunlukta CFTR (Şekil 1, alt) arasında oluştu. Kompleks oluşumu aracılık protein, PDZK1 (Şekil 1, alt) 18 artan miktarlarda ile doza bağımlı arttı.

Şekil 1
Şekil 1. Makromoleküler karmaşık testin bir resimsel gösterimi (üstte). Bir makromoleküler karmaşık bir doza bağımlı (alt) 18 üç protein (GST-MRP4-CT50, O'nun-S-PDZK1 ve Bayrak-CFTRwt) ile in vitro olarak tespit edildi.

2 AR (bkz. 14) CFTR-NHERF2-LPA 2 (bkz. 15) CFTR-PDZ proteinler-MRP 2 (bkz. 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (bkz. 16)
Affinity boncuk Amiloz reçine G-proteinine agaroz Amiloz reçine Glutatyon agaroz
Protein-1 Saf MBP-β 2 AR CT His-S-CFTR CT MBP-CFTR CT GST-MRP4 CT
Protein-2 saflaştırılmış GST-NHERF1 GST-NHERF2 GST-PDZ proteinleri His-S-PDZK1
(Veya hücre lizatları) Protein-3 saflaştırılmış CFTR-wt ya CFTR-his10 (BHK ya HEK hücre lizatları) BayrakLPA-2-wt ya bayrak-LPA 2-ΔSTL (BHK hücre lizatları) MRP2 (MDCK hücre lizatları) Bayrak-CFTR-wt veya CFTR-his10 (veya hücre lizatları) Saf
Antikor Anti-CFTR IgG Anti-Flag HRP Anti-MRP2 IgG Anti-Flag HRP

In vitro monte çeşitli CFTR içeren makromoleküler kompleksleri Tablo 1. Özeti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde Bu şekilde, daha önce 16-19,29,30 bildirilen in vitro monte edilmesi ve saflaştırılmış protein (ya da proteininin parçacıkları) ve / veya hücre lizatları kullanılarak makromoleküler sinyalleşme kompleksi ihtiva eden bir CFTR tespiti için bir yöntemi göstermektedir. Hazırlık sürecinde iyi sonuçlar aşağıdaki kritik noktalar elde etmek için özel dikkat gerektirir:

  • Bu işlem tampon maddesi ile pH adım 1) 'de anlatıldığı gibi GST-füzyon proteinin saflaştırılması sırasında glutatiyon eklendikten sonra 8,0 şekilde ayarlanabilir olması önemlidir. PH glutatiyon eklenmesinden sonra 3,0 gibi düşük olabilir. PH elüsyon önce ayarlanır değilse, elüsyon etkinliğini önemli ölçüde azalır.
  • Protein boncuklar akıtılan zaman, onlar hemen diyaliz gerekir, aksi takdirde, saflaştırılmış protein çözeltisi çıkabileceğini. Protein diyaliz sağ elüsyon sürecinden sonra mümkün değilse, protein Zehir ve inci ile onlara bırakmayıne agaroz / boncuk.
  • Kuvvetle CFTR toplama yaygın bir sorun olarak Western blot için hazırlanan CFTR içeren makromoleküler karmaşık örnekleri kaynatmak için tavsiye edilir. Jeli yerleştirilmiş önce yerine, numuneler 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de ısıtıldı edilmelidir.
  • Düşük afinite etkileşim ile protein kompleksi için, immunoblotting sinyali arttırmak için SuperSignal West Femto (veya Pico) Maksimum Hassasiyet Substrat (Pierce) ile görüntülenmiştir olabilir.

Burada gösterilen tekniği biyokimyasal bir CFTR içeren tersiyer protein kompleksi tanımlamak için uygun ve tekrarlanabilir analiz sağlar. Tablo-1'de belirtildiği gibi in vitro CFTR makromoleküler kompleksleri birleştirmek için birden çok yolu vardır.

  • Etkileyici sonuçlar elde etmek için, bir iki yönde, yani, i) kompleks bir araya getirmesi gerektiğini CFTR - PDZ iskele protein (lar) - Üçüncü protein; ii) üçüncü protein - PDZ iskele protein (lar) - CFTR.
  • PDZ makromoleküler kompleksinin oluşumu motifi-bağımlılığı göstermek amacıyla, CFTR-his10 (CFTR-his10 C-terminal kuyruk 10 His kalıntısı içerir; bu proteinin, bir iç PDZ motifi sahiptir ve NHERFs 29 bağlamak olamaz), bunların sahip proteinler sıra makromoleküler kompleksi deneyde paralel olarak kullanılabilir PDZ motifleri mutasyona uğramış veya (vs gibi β 2 AR-L413A olarak;; LPA 2-ΔSTL) silinir.
  • Bunun yerine, aynı zamanda bir çok diğer bileşenleri içeren bir hücre lizatları bütün kullanarak, bir (örneğin MRP4-PDZK1-CFTR montaj gibi) adım 3,7 azından saflaştırılmış protein (üçüncü bir protein olarak) kullanarak, aynı zamanda kullanılan saflaştırılmış Bayrak-CFTR; ref 18).. Bütün birleştirme sistemi içinde yer alan tek 3 saflaştırılmış protein olduğu gibi, bu, sadece, bir tri-protein kompleksinin zorlayıcı sonuç sağlar.

Bununla birlikte, CFTR makromoleküler kompleksin saptanması, in vitro purifi kullanılarakolarak artmış CFTR veya etkileşen proteinler makromoleküler sinyal karmaşık hücrelerinde endojen ifade birbirini etkileyen bu proteinlerin var olmadığını göstermez ki ed protein (veya protein parçaları) veya hücrelerden lizatları. Bu sorunu gidermek için, eş-immünopresipitasyon gibi hava yolu epitel hücreleri gibi hücreler 16 endojen CFTR kompleksleri değerlendirmek ve epitel hücreleri 17,18 gut yapılabilir. Dahası, kütle spektrometrisi analizi ve 2 boyutlu jel elektroforezi 29 CFTR için bilinmemektedir bağlayıcı ortak belirlemektir gerçekleştirilebilir. Ancak, bu teknikleri göstermek için bu protokol kapsamı dışındadır.

Buna ek olarak, in vivo olarak proteinleri ile etkileşime Subselüler Lokalizasyon da moleküler etkileşimin etkileyebilir. Onlar de olmuş olsa Örneğin, MRP4, CFTR apikal membran öncelikle lokalize ise apikal ve bazolateral hem membranlarda ifade gösterilmiştirPDZ iskele protein PDZK1 18 üzerinden birbirleri ile fiziksel ve işlevsel etkileşim monstrated. Bundan başka, rekombinant proteinlerin aşırı ekspresyonu, mevcut protokolü kullanıldığı gibi, bunların Subselüler Lokalizasyon etkileyebilir ve böylece aksi meydana olmaz etkileşimler sağlar. Verileri yorumlama ve bulguları extrapolating zaman bu ihtimali de dikkate alınmalıdır.

Geçerli protokol PDZ bağımlı CFTR içeren makromoleküler kompleksleri monte prosedürü üzerinde yoğunlaşsa da, bu protokol de olmayan CFTR dahil çoklu-protein kompleksi (PDZ bağımlı veya bağımsız) montaj potansiyel uygulamalar vardır. En son, bu makromoleküler montaj testi kullanılarak, bir reseptörlerinin CXCR2 fiziksel nötrofillerde NHERF1 yoluyla onun downstream efektör PLCβ 2 aracılı bir protein kompleksi oluşturur ve bu makromoleküler CXCR2 karmaşık işlevsel olduğunu göstermiştirkarmaşık (dışsal CXCR2 peptid kullanarak aracılığıyla) önemli ölçüde zayıflatılmış nötrofil fonksiyonları 31 kesintiye olarak alaka.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Çalışmalarımız Amerikan Kalp Derneği (Büyük Güneydoğu Ortaklık) Başlangıç-devlet yardımı 0765185B, Elsa U. Pardee Vakfı'nın araştırma bursu ve Wayne State Üniversitesi intramural başlangıç ​​fonu ve Damar Araştırma Enstitüsü İsis Girişimi ödülü gelen hibelerle desteklenmektedir. In vitro CFTR makromoleküler karmaşık montaj Bu yöntem başlangıçta Dr AP Naren (Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi) tarafından öncülük edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

Tags

Biyokimya Sayı 66 Moleküler Biyoloji Kimya CFTR makromoleküler kompleksi protein etkileşimleri PDZ iskele protein epitel hücre kistik fibrozis
PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn <em>Vitro Analizi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In… More

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter