Detectie van microRNA's in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen
Summary
Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.
Abstract
Microglia cellen van de myeloïde afstamming die zich in het centrale zenuwstelsel (CNS) 1. Deze cellen spelen een belangrijke rol in de pathologie van de vele ziekten die samenhangen met neuroinflammatie zoals multiple sclerose (MS) 2. Microglia in een normale CNS te uiten macrofaag marker CD11b en vertonen een rust-fenotype met het uitspreken van een laag niveau van activatie markers zoals CD45. Tijdens de pathologische gebeurtenissen in het CZS, microglia geactiveerd zoals bepaald worden door verhoogde expressie van CD45 en andere markers 3. De factoren die microglia fenotype en functies in het centraal zenuwstelsel aantasten zijn niet goed onderzocht. MicroRNA (miRNAs) zijn een groeiende familie van geconserveerde moleculen (~ 22 nucleotiden lang) die betrokken zijn bij veel normale fysiologische processen, zoals celgroei en-differentiatie 4 en aandoeningen zoals ontsteking 5. MiRNAs downregulate de expressie van bepaalde genen door binding complementaire sequenties van deir. mRNA's en spelen een belangrijke rol in de activering van aangeboren immuunsysteem cellen waaronder macrofagen 6 en microglia 7. Om te onderzoeken miRNA gemedieerde paden die de microgliale fenotype, biologische functie te definiëren, en om microglia te onderscheiden van andere vormen van macrofagen, is het belangrijk om kwantitatief beoordelen van de expressie van bepaalde microRNA's in verschillende subsets van CNS-ingezeten microglia. Gemeenschappelijke methoden voor het meten van de expressie van miRNAs in het centraal zenuwstelsel zijn onder andere kwantitatieve PCR uit hele neuronaal weefsel en in situ hybridisatie. Echter, kwantitatieve PCR van hele weefsel homogenaat niet wordt het mogelijk de expressie van miRNA in microglia die slechts 5-15% van de cellen van neuronale weefsel vormen. Hybridisatie in situ laat de evaluatie van de expressie van microRNA in specifieke celtypen in weefselcoupes, maar deze methode is niet geheel kwantitatief. In dit rapport beschrijven we een kwantitatieve en senstieve methode voor de detectie van miRNA door real-time PCR in microglia geïsoleerd van normale CNS of tijdens neuroinflammatie met behulp van experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE), een muismodel voor MS. De beschreven methode zal nuttig zijn om het niveau van expressie van microRNA's in microglia in normale CNS of tijdens neuroinflammatie in verband met diverse aandoeningen zoals MS, beroerte, traumatisch letsel, de ziekte van Alzheimer en hersentumoren te meten.
Protocol
Discussion
Onlangs grote belangstelling werd gegeven aan microglia en de betrokkenheid van deze cellen in een groot aantal pathologieën geassocieerd met neuroinflammatie en neurodegeneratie. Daarnaast is de rol van microRNA's in de differentiatie van immuun-en kankercellen sterk gegroeid de afgelopen jaren 5,10. We hebben recent de rol van miR-124 in het onderhoud van niet-geactiveerde of rust-fenotype van microglia in normale CNS 7, maar de rol van de andere soorten van microRNA's in de microglia fe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door de NIH R01 NS071039-01A1 onderzoek te verlenen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referências
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
