Обнаружение микроРНК в Микроглия по ПЦР в реальном времени в нормальном ЦНС и во время Neuroinflammation
Summary
Микроглия проживают макрофагов, которые обеспечивают первую линию защиты и иммунного надзора центральной нервной системы. Микро РНК являются регуляторные молекулы, которые играют важную роль во многих физиологических процессах, включая активацию и дифференциацию макрофагов. В этой статье мы опишем метод для измерения микроРНК в микроглии.
Abstract
Микроглия являются клетками миелоидной линии, которые находятся в центральной нервной системе (ЦНС) 1. Эти клетки играют важную роль в патологии многих заболеваний, связанных с neuroinflammation таких как рассеянный склероз (РС) 2. Микроглия в нормальной нервной выразить макрофагов маркер CD11b и обладают отдыха фенотип, выражая низким уровнем активации маркеров, таких как CD45. При патологических событий в ЦНС, микроглии активируются, как это определено регуляция CD45 и другие маркеры 3. Факторы, влияющие на фенотип микроглии и функции в ЦНС не очень хорошо изучены. Микро РНК (миРНК) представляют собой растущую семью сохраняющихся молекул (~ 22 нуклеотидов), которые принимают участие во многих нормальных физиологических процессах, таких как рост и дифференцировку клеток 4 и патологий, таких как воспаление 5. МиРНК подавляют экспрессию определенных генов-мишеней путем связывания комплементарных последовательностей вл мРНК и играют важную роль в активации врожденного иммунитета клеток, включая макрофаги микроглии 6 и 7. С целью изучения микроРНК-опосредованного пути, которые определяют микроглии фенотип, биологические функции, и отличить микроглии от других видов макрофаги, важно, чтобы количественно оценить выражение частности микроРНК в различных подмножеств CNS-резидент микроглии. Общие методы измерения выражение микроРНК в ЦНС включает количественный ПЦР из цельного нейронной ткани и гибридизация. Тем не менее, количественный ПЦР из цельного гомогената ткани не позволяют оценить выражение микроРНК в микроглии, которые представляют собой лишь 5-15% клеток нейронов ткани. Гибридизации на месте позволяет оценить выражение микроРНК в специфические типы клеток в срезах ткани, но этот метод не совсем количественные. В этом докладе мы описываем количественных и Sensтельным методом для обнаружения микроРНК на ПЦР в реальном времени в микроглии изолирован от нормального ЦНС или при использовании neuroinflammation экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), модель мыши для MS. Описанный метод будет полезен для измерения уровня экспрессии микроРНК в микроглии ЦНС в норме или при neuroinflammation, связанных с различными патологиями, включая MS, инсульт, травмы, болезни Альцгеймера и опухолей головного мозга.
Protocol
Discussion
Недавно значительный интерес был дан микроглии и участие этих клеток во многих патологий, связанных с neuroinflammation и нейродегенеративные. Кроме того, роль микроРНК в дифференцировке иммунной и раковых клеток резко выросли за последние несколько лет 5,10. Ранее мы уже сообщали роль ми?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке НИЗ R01 NS071039-01A1 исследовательский грант.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referências
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
