DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study
Summary
RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene silencing<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA-interferentie (RNAi) remt de expressie van genen door specifiek vernederende doelwit mRNA's. Sinds de ontdekking van double-stranded kleine interferentie RNA (siRNA) in gene silencing 1, is RNAi uitgegroeid tot een krachtig onderzoeksinstrument in functie van een gen studies. Vergeleken met genetische deletie RNAi-gemedieerde silencing bezit vele voordelen, zoals het gemak waarmee het wordt uitgevoerd en geschiktheid voor de meeste cellijnen. Meerdere studies hebben aangetoond dat de toepassingen van RNAi-technologie in het kankeronderzoek. In het bijzonder is de ontwikkeling van de DNA-vector-gebaseerde technologie om kleine hairpin RNA (shRNA) gedreven door de U6 of H1 promotor te produceren gemaakt op lange termijn en induceerbaar gen zwijgen mogelijk 2,3. Het gebruik in combinatie met genetisch gemanipuleerde virale vectoren zoals lentivirus, vergemakkelijkt hoge rendement van shRNA levering en / of integratie in genomisch DNA van stabiele shRNA expressie.
We beschrijven een detailed procedure met behulp van de DNA-vector-gebaseerde RNAi technologie om genfunctie, waaronder de constructie van lentivirale vectoren die shRNA, lentivirus de productie en de cel-infectie, en functionele studies met behulp van een muis xenograft model te bepalen.
Diverse strategieën zijn gemeld bij het genereren van shRNA constructen. Het protocol beschreven gebruik PCR amplificatie en een 3-fragment ligatie kan worden rechtstreeks en efficiënt genereren shRNA bevattende lentivirus constructen zonder dat er extra nucleotide naast een shRNA coderende sequentie. Sinds de shRNA-expressiecassettes die door deze strategie kan worden gesneden door restrictie-enzymen, kunnen ze gemakkelijk worden verplaatst naar andere vectoren met verschillende fluorescerende of antibiotica markers. De meeste commerciële transfectie reagentia kunnen worden gebruikt in lentivirus productie. Echter, in dit rapport geven we een economische methode met behulp van calciumfosfaat neerslag die kan bereiken meer dan 90% transfectie-efficiëntie in293T cellen. Vergeleken met constitutieve shRNA expressievectoren een induceerbaar shRNA is met name geschikt voor slopen een gen essentieel celproliferatie. We tonen de gene silencing van Yin Yang 1 (YY1), een potentiële oncogen bij borstkanker 4,5, door een Tet-On induceerbaar shRNA systeem en de effecten ervan op tumorvorming. Onderzoek met behulp van lentivirus is de beoordeling en goedkeuring van een protocol inzake bioveiligheid door de bioveiligheid Comite van de instelling van een onderzoeker. Onderzoek met behulp van diermodellen is de beoordeling en goedkeuring van een dier protocol door de Animal Care en gebruik Comite (ACUC) van de instelling van een onderzoeker.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode te kloppen in een gen met behulp van shRNA en visualisering van haar biologisch effect met behulp van lichtgevende beeldvorming van de groei van tumorcellen in vivo. Het doel site van een shRNA mag niet een van de drie restrictieplaatsen bevatten (BamHI, Hindlll en EcoRI) die worden gebruikt voor subklonering. In een zeldzaam scenario wanneer een van deze sites aanwezig is, kan een extra restrictie-enzym worden gebruikt om hem te vervangen in het genereren van het construct. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door het Research Scholar-subsidies (116.403-RSG-09-082-01-MGO) van de American Cancer Society en intramurale fondsen van Wake Forest University Health Sciences aan GS. DBS werd ondersteund door NCI training subsidie 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
Referências
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
