DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study
Summary
RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von Gen-Silencing<em> In-vivo-</em>.
Abstract
RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert die Genexpression durch speziell erniedrigender Ziel-mRNAs. Seit der Entdeckung des doppelsträngige small interference RNA (siRNA) in Gen-Silencing-1, hat RNAi zu einem mächtigen Werkzeug der Forschung in der Gen-Funktions-Studien. Im Vergleich zu genetische Deletion besitzt RNAi-vermittelten Gen-Silencing viele Vorteile, wie die Leichtigkeit, mit der sie durchgeführt wird und seine Eignung für die meisten Zelllinien. Mehrere Studien haben die Anwendungen der RNAi-Technologie in der Krebsforschung nachgewiesen. Insbesondere hat die Entwicklung der DNA-Vektor-basierte Technologie für kleine doppelsträngige RNA (shRNA) von der U6 oder H1-Promotor angetrieben produzieren langfristig und induzierbare Gen-Silencing 2,3 möglich gemacht. Seine Verwendung in Kombination mit gentechnisch viralen Vektoren, wie Lentivirus, ermöglicht eine hohe Effizienz der shRNA Lieferung und / oder Integration in die genomische DNA für eine stabile Expression shRNA.
Wir beschreiben eine detailed Prozedur mit dem DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie, um die Genfunktion, einschließlich Konstruktion von lentiviralen Vektoren, shRNA, Lentivirus Produktions-und Zell-Infektion und funktionelle Studien mit einer Maus-Xenograft-Modell zu bestimmen.
Verschiedene Strategien wurden bei der Erzeugung shRNA Konstrukte berichtet worden. Die hier beschriebene Protokoll unter Verwendung PCR-Amplifikation und eine 3-Fragment-Ligation verwendet werden, um direkt und effizient zu erzeugen shRNA enthaltenden lentiviralen Konstrukte, ohne irgendwelche zusätzliche Nukleotid benachbart zu einem shRNA kodierenden Sequenz. Da die shRNA-Expressionskassetten dieser Strategie erzeugt werden durch Restriktionsenzymen geschnitten werden, können sie leicht auf andere Vektoren werden mit unterschiedlichen fluoreszierenden oder antibiotische Marker bewegt. Die meisten kommerziellen Transfektionsreagenzien kann in Lentivirus genutzt werden. Allerdings ist in diesem Bericht stellen wir ein wirtschaftliches Verfahren mit Calciumphosphat-Präzipitation, die erreichen können über 90% Transfektionseffizienz in293T-Zellen. Im Vergleich zu einer konstitutiven shRNA Expressionsvektoren, ein induzierbarer shRNA System besonders geeignet, um einen Zuschlag essentiellen Gens, um die Zellproliferation. Wir zeigen die Gen-Silencing von Yin Yang 1 (YY1), einem potenziellen Onkogens bei Brustkrebs 4,5, durch ein Tet-On-induzierbaren shRNA-System und seine Auswirkungen auf die Tumorbildung. Forschung mit Lentivirus erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Biosafety-Protokoll von der Kommission für Biosicherheit der eines Forschers Institution. Forschung mit Tiermodellen erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Tieres Protokoll, das von der Animal Care und Use Committee (ACUC) der eines Forschers Institution.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um knock down ein Gen mit shRNA und visualisieren ihre biologische Wirkung mit Biolumineszenz-Bildgebung das Wachstum von Tumorzellen in vivo. Der Zielort einer shRNA darf keine der drei Restriktionsstellen (BamHI, HindIII und EcoRI) verwendet für die Subklonierung. In einer seltenen Fall, wenn eine dieser Seiten vorhanden ist, kann eine zusätzliche Restriktionsenzym verwendet werden, um es bei der Erzeugung des Konstrukts zu ersetzen.
Meh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Research Scholar Grants (116403-RSG-09-082-01-MGO) von der American Cancer Society und intramuralen Mittel von der Wake Forest University Health Sciences an GS unterstützt. DBS wurde von NCI Ausbildungsförderung 5T32CA079448 unterstützt.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
Referências
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
