Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim
Summary
RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite arttı<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA müdahalesi (RNAi) özellikle aşağılayıcı hedef mRNA tarafından gen ekspresyonunu inhibe. Gen suskunluğu 1 çift zincirli küçük parazit RNA (siRNA) keşfinden beri, RNAi gen fonksiyonu çalışmalarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştir. Genetik delesyon ile karşılaştırıldığında, RNAi-aracılı gen suskunluğu gibi bu gerçekleştirildiği ile kolaylıkla ve en hücre serileri için uygunluğu gibi birçok avantajı, sahiptir. Çoklu çalışmalar kanser araştırma RNAi teknolojinin uygulamaları göstermiştir. Özellikle, U6 veya H1 promotör tarafından tahrik küçük firkete RNA (shRNA) üretmek için DNA vektörü tabanlı teknolojinin geliştirilmesi mümkün 2,3 susturulmasında uzun vadeli gen ve indüklenebilir yapmıştır. Böyle lentivirüs gibi genetiği viral vektörlerin, birlikte kullanımı stabil shRNA ifade için genomik DNA'ya shRNA teslimat ve / veya entegrasyon yüksek verimlilik kolaylaştırır.
Bir detaile tarifd prosedürü shRNA, lentivirüs üretimi, hücre enfeksiyonu, ve bir fare xenograft modeli kullanılarak fonksiyonel çalışmalar ifade vektörlerinin lentiviral inşaat dahil geni fonksiyonu, belirlemek için DNA vektörü bazlı RNAi teknolojisi kullanılarak.
Çeşitli stratejiler shRNA yapıları oluşturmak bildirilmiştir. Protokol PCR büyütmesi ve bir 3-fragmanı ligasyon kullanıldığı doğrudan ve verimli bir şekilde üretmek için kullanılabilir burada açıklanan shRNA-içeren bir shRNA kodlama sekansı için herhangi bir ek nükleotid bitişik çıkmadan lentiviral yapıları. Bu stratejinin yarattığı shRNA ifade kasetleri restriksiyon enzimleri tarafından kesilebilir olduğundan, bunlar kolaylıkla farklı floresan veya antibiyotik işaretleri ile diğer vektörlere taşınmış olabilir. En çok ticari transfeksiyon reaktifler lentivirüs üretiminde kullanılabilir. Ancak, bu raporda, biz% 90 transfeksiyon verim üzerinde elde edebilirsiniz kalsiyum fosfat kullanarak ekonomik bir yöntem sağlamak293T hücreler. Bünye shRNA ifade vektörlerinin karşılaştırıldığında, indüklenebilir shRNA sistemi hücre çoğalması için gerekli bir gen aşağı vurma özellikle uygundur. Biz Yin Yang 1 (YY1), meme kanseri 4,5 potansiyel bir onkogeninin gen susturulması göstermek, bir Tet-On indüklenebilir shRNA sistemi ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri. Lentivirüs kullanarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Biyogüvenlik Komitesi tarafından bir biyogüvenlik protokolü onayı gerektirir. Hayvan modelleri kullanılarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından bir hayvan protokolünün onaylanması gerekiyor.
Protocol
Discussion
Bu protokol kullanılarak bir gen shRNA sökülebilen ve in vivo olarak tümör hücresi büyümesinin bioluminescent görüntüleme kullanılarak biyolojik etkisini canlandırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir shRNA hedef sitesi (BamHI, HindIII ve EcoRI) kullanılan üç sınırlandırma bölgeleri herhangi bir içermemelidir on klonlama sonrasında için. Nadir bir senaryo bu siteleri arasında herhangi bir mevcut olduğu zaman, ilave bir kısıtlama enzimiyle yapı üreten yerini almak ü…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Araştırmacı Amerikan Kanser Derneği Hibeler (116.403-RSG-09-082-01-MGO) ve GS Wake Forest Üniversitesi Sağlık Bilimleri intramural fonları kısmen desteklenmiştir. DBS NCI eğitim bursu 5T32CA079448 tarafından desteklenmiştir.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
Referências
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
