DNA Vector-baserte RNA interferens for å studere gen-funksjon hos Cancer
Summary
RNA interferens (RNAi) besitter mange fordeler over genet knockout, og har vært bredt brukes som et verktøy i genet funksjonelle studier. Oppfinnelsen av DNA vektorbasert RNAi teknologi har gjort langsiktig og induserbar genet knockdown mulig, og også økt muligheten for genet Silencing<em> In vivo</em>.
Abstract
RNA interferens (RNAi) hemmer genuttrykket ved spesifikt nedverdigende målet mRNA. Siden oppdagelsen av dobbel-strandet liten forstyrrelse RNA (siRNA) i genet stanse 1, har RNAi blitt et kraftig verktøy for forskning i gen-funksjon studier. Sammenlignet med genetisk sletting, besitter RNAi-mediert genet Silencing mange fordeler, for eksempel på hvor enkelt det er utført og dets egnethet til de fleste cellelinjer. Flere studier har demonstrert anvendelser av RNAi teknologi i kreftforskning. Særlig har utviklingen av DNA vektorbasert teknologi for å produsere små hårnål RNA (shRNA) drevet av U6 eller H1 promoter laget langsiktig og induserbar genet stanse mulig 2,3. Bruken i kombinasjon med genmodifiserte virale vektorer, som lentivirus, forenkler høye effektiviteten av shRNA levering og / eller integrering i genomisk DNA for stabil shRNA uttrykk.
Vi beskriver en detailed prosedyren ved hjelp av DNA vektorbasert RNAi teknologi for å bestemme gen funksjon, inkludert bygging av lentiviral vektorer som uttrykker shRNA, lentivirus produksjon og celle infeksjon, og funksjonelle studier ved hjelp av en mus xenograft modell.
Ulike strategier har blitt rapportert i å generere shRNA konstruksjoner. Protokollen er beskrevet her ansette PCR forsterkning og en tre-fragment ligation kan brukes til direkte og effektivt generere shRNA-inneholder lentiviral konstruksjoner uten å etterlate noen ekstra nukleotid ved et shRNA kodende sekvens. Siden shRNA-uttrykk kassetter opprettet av denne strategien kan bli kuttet ut av restriksjonsenzymer, de kan lett flyttes til andre vektorer med forskjellige lysrør eller antibiotika markører. De fleste kommersielle transfeksjon reagenser kan brukes i lentivirus produksjon. Men i denne rapporten gir vi en økonomisk metode med kalsiumfosfat nedbør som kan oppnå over 90% transfeksjon effektivitet i293T celler. Sammenlignet med konstitutive shRNA uttrykk vektorer, er en induserbar shRNA system spesielt egnet til å slå ned et gen viktig for cellevekst. Vi viser genet stanse Yin Yang 1 (YY1), en potensiell onkogen i brystkreft 4,5, ved en Tet-On induserbar shRNA system og dens virkninger på tumordannelse. Forskning hjelp lentivirus krever gjennomgang og godkjennelse av en biosikkerhet protokoll av biosikkerhet komité forsker institusjon. Forskning bruke dyremodeller krever gjennomgang og godkjenning av et dyr protokoll fra Animal Care og bruk Committee (ACUC) av en forskers institusjon.
Protocol
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å slå ned et gen ved hjelp shRNA og visualisere sin biologiske effekten ved hjelp Bioluminescent avbildning av svulst celle vekst in vivo. Målet stedet av en shRNA bør ikke inneholde noen av de tre restriksjonsenzymer nettstedene (BamHI, HindIII og EcoRI) benyttet for subcloning. I et sjeldent scenario når noen av disse nettstedene er til stede, kan en ytterligere begrensning enzym brukes til å erstatte den i å generere konstruktet.
F…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av stipendiat Grants (116403-RSG-09-082-01-MGO) fra American Cancer Society og egenutført midler Wake Forest University Health Sciences til GS. DBS ble støttet av NCI trening bevilgning 5T32CA079448.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
Referências
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. The oncogenic role of Yin Yang 1. Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).
- Wan, M. Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27. Am. J. Pathol. , (2012).
- Sui, G., Shi, Y. Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology. Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).
- Trower, M. K. A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts. Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Zhang, B. The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events. Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).
- Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
- Rubinson, D. A. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, 401-406 (2003).
- Sui, G. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53. Cell. 117, 859-872 (2004).
