Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Summary

Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit Nanometer-Präzision durch verstellbarem Winkel Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) gemessen.

Abstract

Oberflächentopologie, z. B. von Zellen wachsen auf einem Substrat, mit Nanometer-Präzision durch unterschiedlichen Winkeln Total Internal Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (VA-TIRFM) bestimmt. Zellen werden auf transparente Folien kultiviert, gewaschen und mit einem fluoreszierenden Marker homogen in ihrem Plasma Membran verteilt. Beleuchtungssystem tritt durch einen parallelen Laserstrahl unter variablen Winkeln der inneren Totalreflexion (TIR) ​​mit unterschiedlichen Eindringtiefen der evaneszenten elektromagnetischen Feldes. Aufzeichnung von Bildern bei Bestrahlung Fluoreszenz bei etwa 10 unterschiedlichen Winkeln ermöglicht, Zell-Substrat-Abstände mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern berechnen. Unterschiede der Haftung zwischen verschiedenen Zelllinien, zB Krebszellen und weniger malignen Zellen werden somit bestimmt. Darüber hinaus können eventuelle Änderungen der Zelladhäsion auf chemische oder photodynamischen Behandlung geprüft. Im Vergleich mit anderen Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie Belichtung gehalten wirdsehr klein, und keine Beschädigung der lebenden Zellen erwartet wird.

Introduction

Wenn ein Lichtstrahl durch ein Medium ausbreitet der Brechungsindex n ₁ eine Schnittstelle erfüllt, um ein zweites Medium mit einem Brechungsindex n ₂ <n ₁ tritt Totalreflexion an alle Einfallswinkel Θ, der größer als der kritische Winkel Θ _c = sind arcsin (n ₂ / n _1). Obwohl sie total reflektiert das einfallende Lichtstrahl Wucht einem evaneszenten elektromagnetischen Felds, das in das zweite Medium und nimmt exponentiell mit senkrechten Abstand z von der Grenzfläche eindringt gemäß I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) entspricht der Intensität des elektromagnetischen Feldes und d (Θ) zu der Eindringtiefe bei der Wellenlänge λ, wie gegeben durch

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ - n _{² 2)} ^{-1 / 2}

Wie in der Literatur ^1,2 berichtet, ₀ I e mit der Transmissionsfaktor T (Θ) und dem Verhältnis n ₂ / n ₁ multipliziert. Wenn der elektrische Feldvektor des Lichts polarisiert ist senkrecht zur Einfallsebene (dh die Ebene, die durch den einfallenden und den reflektierten Strahl aufgespannten) wird diese Transmissionsfaktor gegeben durch

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [ein - (n ₂ / nL ₁₎ ^2]

Für den erfassten Fluoreszenzintensität in TIRFM Messungen hat Lichtabsorption, über alle Schichten der Probe integriert werden und multipliziert mit der Fluoreszenzquantenausbeute η des jeweiligen Farbstoff sowie mit der Raumwinkel Ω Detektion. Wie bereits berichtet ^3, kann diese Intensität beschrieben werden durch

I _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

wenn alle Faktoren f die unabhängig sind rom der Einfallswinkel Θ und die Koordinate z innerhalb des experimentellen konstanten A. Gleichung 3 enthalten kann analytisch gelöst werden, wenn die Konzentration c (z) von Fluorophoren vorliegt, gilt als nahezu konstant

- Entweder überhaupt Koordinaten z ≥ Δ, im Zytoplasma von Zellen mit einem Abstand Δ von der Schnittstelle zB. In diesem Fall weist das Integral von z = Δ bis z = ∞ was zu berechnen

I _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Oder zwischen z = Δ - t / 2 und z = + Δ t / 2, dh innerhalb einer dünnen Schicht mit einer Dicke t, zB einer Zellmembran in einem Abstand Δ von der Schnittstelle angeordnet ist. In diesem Fall kann die Fluoreszenzintensität berechnet werden als

I _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ)}

wenn t im Vergleich mit Δ klein.

ent "> Aus den Gleichungen (4) und (5) Zell-Substrat-Abstände Δ berechnet werden, wenn die Bilder der Fluoreszenzintensität I _F für variable Winkel Θ aufgezeichnet werden, und wenn ln (I _F / T d) (Gl. 4) oder ln (I _F / T) (Gl. 5) als Funktion von 1 / d für diese Winkel ausgewertet. Für die Membran Marker Laurdan in diesem Papier verwendet (s. unten) die Auswertung nach Gl. 5 durchgeführt wurde.

Wie bereits berichtet ^3, Bildaufnahme und Auswertung benötigt
- Homogene Verteilung von Anregungslicht über die Probe,
- Gültigkeit einer 2-Schichten-Modells (mit den Brechungsindizes n ₁ und n ₂ für das Substrat und das Zytoplasma, jeweils). Dies gilt, wenn die Plasmamembran ist sehr dünn, und wenn die Schicht aus dem extrazellulären Medium (zwischen der Zelle und dem Substrat) klein ist im Vergleich zur Wellenlänge des einfallenden Lichts.

Zusätzlich kann eine moderate numerische Apertur(Typischerweise A ≤ 0,90) des Mikroskops Objektivlinse ist vorteilhaft, Abweichungen der Helligkeit aufgrund Anisotropie von Strahlung im nahen Feld des Dielektrikum-Grenzfläche zu vermeiden.

Protocol

Ein. Seeding und Inkubation der Zellen

1. Saatgut einzelnen Zellen, zB U373-MG oder U-251 MG-Glioblastomzellen mit einer typischen Dichte von 100 Zellen / mm ² auf einem Glasträger und wachsen sie für 4872 Stunden in Kulturmedium (zB RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika) mit einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Inkubieren von Zellen mit einer Membran-Marker, zB 6-Dodecanoyl-2-dimethylamino Naphthalin (Laurdan) für 60 min bei einer Konzentration von 8 uM (in Kulturmedium) ^4, oder eines Cytoplasma-Marker aufgebracht, angewendet zB Calcein acetomethlyester 40 min bei einer ^4,5; Konzentration von 5 uM ^3, oder eine Membran zugeordnet Photosensibilisator Protoporphyrin IX z. B. auf 4 h Inkubation mit seiner Vorstufe 5-Aminolävulinsäure (1 mM 5-ALA) induziert.
3. Waschen der Zellen mit Kulturmedium oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vor der Fluoreszenzmikroskopie. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Verwenden Sie einen aufrechten Mikroskop, z. B. Zeiss Axioplan, und ersetzen Sie ihre Kondensator durch eine Beleuchtungseinrichtung, wie in Lit. beschrieben. 3 mit einer halbkugelförmigen oder halbzylindrischen Glasprisma optisch mit dem Objektträger verbunden (siehe Abbildung 1).
2. Verwenden eines parallelen kollimierten Laserstrahls das nach Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten (zB Hohlspiegel) resultiert wiederum in einer parallelen Strahls auf der Oberfläche der Probe (telezentrische Pupille ray). Achten Sie darauf, dass der elektrische Feldvektor senkrecht polarisiert sind zu der Einfallsebene ist.
3. Verwenden einer einstellbaren Spiegel innerhalb des Kondensators, der in der Probe abgebildet wird und beleuchtet die Probe unter einem variablen Anstellwinkel (Objektstrahl) befindet. Die verstellbare Spiegel kann durch einen Schrittmotor angetrieben werden, wobei jede Position einem gut definierten Einfallswinkel, wie durch Messungen goniometrischen ³ bestimmt
4. Kalibrieren der Winkelposition des verstellbaren Spiegels mit dem kritischen Winkel Θ _c = 61,3 ° für ein Glas-Wasser-Übergang als ein fester Wert. Θ _c visualisiert werden bei Variation der Θ wenn ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 1 mM Flavinmononucleotid, FMN) in Wasser gelöst ist. Die Position des Spiegels bei Θ = Θ _c ist in dem Spiegel Positionierprogramm gespeichert.
5. Stellen Sie die Parameter der Kamera (hinten beleuchtet Andor Ixon EMCCD, DV887DC, Andor Technology, Belfast, UK ^6), einschließlich Temperatur, Verstärkung, Aufnahmezeit und Schaltgeschwindigkeit.
6. Verwenden Sie ein Objektiv von geeigneten Vergrößerung und bevorzugt moderate numerische Apertur (z. B. 40 × / 0,75 oder 63 × / 0,90 Eintauchen in Wasser) und lokalisieren Sie die Objektträger unter dem Mikroskop. Verwenden Immersionsöl, um optischen Kontakt der Probe mit dem Glasprisma gewährleisten. Aufzuzeichnen Fluoreszenzbilder von identischen Proben auf die VariationBeleuchtungswinkel (Θ ≥ Θ _c mit Θ _c entspricht 64,5 ° für eine Zell-Glas-Grenzfläche). Ein Winkelbereich von 66 ° -74 ° in Schritten von 0,5 ° oder 1 ° empfohlen. Verwenden ein geeignetes Langpass oder Bandpassfilter zum Fluoreszenzdetektion.

3. Data Analysis

1. Lesen von Bildern (zB im ASCII-Format) in verschiedenen Winkeln Θ sowie den Kameraeinstellungen (für Hintergrund Diskriminierung), der Anregungswellenlänge und den Brechungsindizes für Glas (n ₁ = 1,52) und Zellen aufgenommen (n ₂ = 1,37) in die Auswertung Programm (LabView; NanoCell). Für jeden Satz von Parametern die Eindringtiefe d (Θ) und der Transmissionsgrad T (Θ) werden automatisch berechnet.
2. Wählen Sie die Bilder zur Auswertung von Zell-Substrat-Distanzen Δ nach Gleichung 5 (Membran Marker) oder Gleichung 4 (Zytoplasma Marker), Einzelne Bilder mit inhomogenerBeleuchtung (aufschlussreiche e, g. Streifen) kann ausgeschlossen werden.
3. Berechnen Sie Bilder von Zell-Substrat-Topologie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige. Bei der Auswertung Profile der einzelnen Pixel dargestellt werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Anpassung verwendet werden.
4. Bewahren Sie die Auswertung Protokoll.

4. Repräsentative Ergebnisse

Vertreter Experimente mit gentechnisch veränderten U251-MG Glioblastom-Zellen freundlicherweise von Prof. Jan Mollenhauer, Abteilung Molekulare Onkologie, Universität Süddänemark, Odense zugeführt wird. In zwei Subklone dieser U251 Zellen die Tumorsuppressorgene oder TP53 PTEN sind überexprimiert Verwendung eines Tet-On Induzierbares Expressionssystem, derart, dass diese Zellen einen verminderten tumorigene Potential aufweisen und können als weniger malignen anzusehen. Hochmalignen U251-MG Zellen ohne Suppressor-Gen sind als Kontrollen verwendet, und U251-MG Wildtyp-Zellen dienen einem weiteren Vergleich. Eine Laserdiode Emittieren eines quasi kontinuierliche Reihe von Pikosekundenpulse (LDH400 mit Treiber PDL 800-B, PicoQuant, Berlin, Deutschland; Wellenlänge: 391 nm; Pulsenergie: 12 PJ; Wiederholungsrate: 40 MHz) als Anregungsquelle verwendet.

In 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten TP53 Tumorsuppressorgens und inkubiert mit Laurdan (8 uM, 60 min) werden für Einfallswinkel von 66,0 °, 69,0 ° und 73,0 ° entsprechend Eindringtiefen der abgebildete evaneszenten elektromagnetischen Feld von etwa 140 nm, 75 nm und 60 nm aufweisen. Mit abnehmender Eindringtiefe Fluoreszenz Intensität abnimmt (siehe Skalen) und stammt aus oberflächlicher Seiten der Zellen (zB fokalen Kontakten auf ihren Kanten). Zell-Substrat-Abstände (visualisiert in Abbildung 3d durch einen Farbcode zwischen 0 bis 600 nm) stark in den Zellen zwischen auf unterschiedlichly wenige Nanometer (weiß-gelb) und 250-300 nm (dunkelrot), dh fokale Kontakte und größere Zell-Substrat-Abstände sind in unmittelbarer Nähe. Das gleiche gilt für U251-MG Glioblastomzellen mit einer aktivierten Suppressorgen PTEN (4d), während Zell-Substrat-Abstände relativ konstant sind für U251-MG-Steuerung und Wildtyp-Zellen mit typischen Werten von 80 bis 100 nm (gelb; 4b ) und 150-200 nm (orange-rot; Abbildung 4a).

Abbildung 1. Beleuchtungseinrichtung für VA-TIRFM in einem aufrechten Mikroskop. Eine einstellbare Spiegel durch einen Schrittmotor angetrieben erlaubt eine Winkelauflösung von ± 0,25 °.

Abbildung 2. Auswertung Profil für ein pixel (schematisch). Wenn ln [I _C / T (Θ)] in Abhängigkeit von 1 / d (Θ) aufgetragen ist, stellt die Steigung der Zell-Substrat-Abstand Δ. Diese Steigung wird üblicherweise mit einer Genauigkeit von etwa ± 10% bestimmt. Ein Wert - resultierend aus inhomogenen Beleuchtung - markiert wurde und ausgeschlossen von der Auswertung.

Abbildung 3 TIRFM Bilder der U251-MG Glioblastomzellen mit aktivierten TP53 Suppressorgen nach Inkubation mit Laurdan (8 uM, 60 min). Aufgezeichnet bei verschiedenen Beleuchtungswinkeln (ac); Zell-Substrat-Abstände im Bereich von 0-600 nm gezeigten durch einen Farbcode (d); Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &mgr; m × 210 &mgr; m Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 4 Zell-Substrat-Abstände von U251-MG glioblatoma Zellen im Bereich von 0-600 nm durch einen Farbcode gezeigt;. (A) Wildtyp (b) steuert, (c) Zellen mit aktivierten Suppressorgen TP53, (d) Zellen mit aktiviertem Suppressor-Gen PTEN; Anregungswellenlänge: 391 nm, Detektion: ≥ 420 nm; image size:. 210 &mgr; m × 210 &mgr; m Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Es wird ein Verfahren zum Messen Zell-Substrat-Abstände mit Nanometer-Präzision beschrieben. Derzeit Methoden der super-hochauflösenden Mikroskopie, zB auf strukturierte Beleuchtung ⁷ oder auf Einzelmoleküldetektion ^8-10 sowie stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie ¹¹ sind von großem Interesse basiert. Keine dieser Techniken erlaubt jedoch eine axiale Auflösung unterhalb von 50 nm aufweist. Darüber hinaus relativ hohe Bestrahlungsstärke von 50100 W / cm ² ist für einzelnes Molekül Methoden und mehr als 3.000 W / cm ² für STED-Mikroskopie benötigt. Dies übersteigt Sonneneinstrahlung (etwa 100 mW / cm ²⁾ durch mehrere Größenordnungen, so dass eine schnelle Beschädigung lebenden Zellen ist wahrscheinlich. In VA-TIRFM Experimenten kann jedoch Bestrahlungsstärke auf weniger als 20 mW / cm ² beschränkt und erlaubt Belichtungszeiten von einigen Minuten oder sogar Stunden ohne Schädigung der lebenden Zellen ^12, so dass dauerhafte Experimente mit multiple Aufnahmen scheinen gut möglich. Wesentliche Voraussetzungen für jedes Experiment gibt gute Winkel Kalibrierung und eine homogene Ausleuchtung der sauberen Objektträger.

VA-TIRFM können zu zahlreichen Themen der technische oder biologische Oberflächen, z. B. Messung von Zelladhäsion an einem transparenten Substrat aufgebracht werden. Zellwachstum, Migration oder Zelltod (zB Apoptose) kann daher genauer untersucht werden. Kürzlich wurde die Rolle von intrazellulärem Cholesterin auf Zelladhäsion ⁴ untersucht. Insbesondere stellte sich heraus, dass die Anzahl der Zell-Substrat-Kontakte bei Entleerung des Cholesterins wurde von 3050% reduziert und schließlich zur Ablösung von einer größeren Anzahl von Zellen aus ihrem Substrat. Zelladhäsion wurde auch bei Anwendung von Photosensibilisatoren üblicherweise in der photodynamischen Therapie (PDT) von Krebs und anderen Erkrankungen verwendet ¹³ untersucht. Es stellte sich heraus, dass bei Bestrahlung mit nicht-phototoxische Lichtdosen Zell-Substrat-Abstandwurden leicht reduziert (möglicherweise aufgrund einiger Schwellung der Zelle), während fokalen Adhäsionen wurden beibehalten ^4,5. Daher war die Bildung von Metastasen durch PDT nicht wahrscheinlich. Vorliegenden Experimente zeigen Unterschiede der Zelladhäsion zwischen Tumor (Glioblastom) und weniger bösartigen Zellen. Nur zukünftige Experimente werden zeigen, ob diese unterschiedliche Verhalten für diagnostische, pharmakologischen oder therapeutischen Anwendungen verwendet werden kann.

Es sollte betont werden, dass die Messungen der Zell-Substrat-Kontakte zurück bis Anfang der TIRF-Mikroskopie ¹⁴ werden. Winkelauflösung jedoch erforderlich, ziemlich komplexe Geräte ^15, so weit, und nur die Entwicklung eines kompakten Beleuchtungseinrichtung für variablem Winkel TIRFM ³ zulässig Routine-Messungen der Zell-Substrat-Topologie. Zusätzlich zu diesem Prisma-Typ TIRFM wurde Miniaturisierung durch objective-type TIRFM ^16,17, wo ein einzelner Punkt (oder Ring) an den Rand des nahe eingeführtdie Aperturebene des Mikroskopobjektivlinse beleuchtet wird, so dass Licht auf die Probe unter einem Winkel abfallen Θ ≥ Θ _C. Daher werden hohe Apertur Objektivlinsen erlauben einen Winkelbereich von etwa 66 bis 75 ° benötigt. Abstimmen des Winkels Θ, erfordert jedoch eine definierte Verschiebung des Laserfokus innerhalb eines Abstandes von weniger als 100 um, die schwierig durchzuführen, selbst in einem vermarktungsfähigen TIRFM Mikroskop ist. Weitere Nachteile hoher Apertur (und hoher Vergrößerung) Objektive sind Nahfeld Anisotropie und eher begrenzt Objektfelder. Daher kann im Vergleich mit Objektiv-Typ TIRFM Versuchsaufbauten wie in diesem Manuskript beschrieben sind bevorzugt zum Messen Zell-Substrat-Topologie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera