Generasjon av menneskeskapte pluripotente stamceller fra perifert blod Bruke STEMCCA lentiviral Vector
Summary
Her vi viser en enkel og effektiv protokoll for generering av humane iPSCs 3-4 ml perifert blod ved hjelp av en enkelt lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lett tilgjengelige blodceller lover å akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø.
Abstract
Gjennom ektopisk uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer, Oct4, Klf4, Sox2 og cMyc, kan menneskelige somatiske celler bli konvertert til en pluripotent tilstand, genererer såkalte induserte pluripotente stamceller (iPSCs) 1-4. Pasient-spesifikke iPSCs mangler etiske bekymringer som omgir embryonale stamceller (ESCs) og ville hoppe mulig immun avvisning. Dermed har iPSCs vakt betydelig oppmerksomhet for sykdom modellering studier, screening av farmakologiske stoffer, og regenerative terapier 5.
Vi har vist generering av transgene-frie mennesker iPSCs fra pasienter med ulike lungesykdommer hjelp av en enkelt excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Kassett (STEMCCA) koding Yamanaka faktorene 6. Disse IPSC linjer ble generert fra hudfibroblaster, den vanligste celletype som brukes for omprogrammering. Normalt, skaffe fibroblaster trenger en hud punch biopsi etterfulgt av ekspansjon av cellens i kultur for noen passasjer. Viktigere, har en rekke grupper rapporterte omprogrammering av humant perifert blod celler til iPSCs 7-9. I en studie ble en Tet induserbar versjon av STEMCCA vektor ansatt 9, som krevde blodcellene til å bli samtidig infisert med en konstitutivt aktiv lentivirus koder for revers tetracyklin transactivator. I motsetning til fibroblaster, kan perifere blodceller samles via minimalt invasive prosedyrer, sterkt redusere ubehag og nød av pasienten. En enkel og effektiv protokoll for omprogrammering blodceller ved hjelp av en konstituerende enkelt excisable vektor kan akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø. Videre omprogrammering av perifere blodceller tillater generering av iPSCs fra enkeltpersoner som hud biopsier bør unngås (ie. Avvikende arrdannelse) eller på grunn av pre-eksisterende sykdomstilstander preventing tilgang til punch biopsi.
Her viser vi en protokoll for generering av menneskelige iPSCs fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjelp av en enkelt floxed-excisable lentiviral vektor konstitutivt uttrykker de 4 faktorene. Fersk eller tint PBMC er utvidet for 9 dager som beskrevet 10,11 i medium som inneholder askorbinsyre, SCF, IGF-1, IL-3 og EPO før de transduced med STEMCCA lentivirus. Cellene blir deretter platet ut på MEFs og ESC-lignende kolonier kan visualiseres to uker etter infeksjon. Endelig er utvalgte kloner utvidet og testet for ekspresjon av de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. Denne protokollen er enkel, robust og svært konsistent, og gir en pålitelig metode for generering av humane iPSCs fra lett tilgjengelig 4 ml blod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi heri beskrive bruken av STEMCCA lentiviral vektoren å generere humane iPSCs fra mononukleære celler isolert fra noen få milliliter av ferskt innsamlet perifert blod. Protokollen kan også brukes til å omprogrammere frosne PBMC (oppnådd direkte fra buffy coat), en detalj av betydelige praktiske implikasjoner når utnytte donorceller anskaffet fra et fjernt sted. Før induksjon av omprogrammering, må isolerte PBMC gjennomgå en kritisk utvidelse trinn som gjør en sunn proliferating populasjon av celler mer motta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Disse studiene ble finansiert delvis av NIH UO1HL107443-01-prisen til GJM og GM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
