Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor
Summary
Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.
Abstract
Durch die ektopische Expression von vier Transkriptionsfaktoren, Oct4, Klf4, Sox2 und cMyc können menschliche Körperzellen zu einer pluripotenten Zustand umgewandelt werden, erzeugen so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 1-4. Patienten-spezifischen iPS fehlen die ethischen Bedenken, die embryonalen Stammzellen (ESC) umgeben und möglich wäre Immunabwehr zu umgehen. So haben iPSCs große Aufmerksamkeit für die Krankheit Modeling-Studien, das Screening von pharmakologischen Verbindungen und regenerative Therapien 5 angezogen.
Wir haben die Erzeugung von Transgen-freien menschlichen iPS von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen mit einer einzigen verbrauchsteuerpflichtiger polycistronischen lentiviralen Stem Cell Kassette (STEMCCA) Codieren der Yamanaka Faktoren 6 gezeigt. Diese Linien wurden iPSC aus Hautfibroblasten, die häufigste Zelltyp zum Umprogrammieren verwendet erzeugt. Normalerweise erfordert ein Erhalten Fibroblasten Haut Stanzbiopsie gefolgt durch Expansion der Zelles in der Kultur für ein paar Passagen. Wichtigerweise haben eine Anzahl von Gruppen die Umprogrammierung von menschlichen peripheren Blutzellen in IPSCs 7-9 berichtet. In einer Studie wurde eine induzierbare Tet Version des STEMCCA Vektor 9 verwendet, welche erforderlich ist, um die Blutzellen gleichzeitig mit einem konstitutiv aktiven Lentivirus Codieren des Reverse Tetracyclin-Transaktivator-infiziert. Im Gegensatz zu Fibroblasten, kann peripheren Blutzellen mittels minimal-invasive Verfahren gesammelt werden, stark reduziert die Beschwerden und Leiden des Patienten. Eine einfache und effektive Protokoll zur Reprogrammierung Blutkörperchen Verwendung eines konstitutiven einzigen verbrauchsteuerpflichtiger Vektor kann die Anwendung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen. Darüber hinaus Umprogrammierung der Zellen des peripheren Blutes ermöglicht die Erzeugung von iPS von Einzelpersonen in der Hautbiopsien vermieden werden (dh. Aberrante Narbenbildung) oder sollten aufgrund bereits bestehenden Krankheitszuständen preventing Zugang zu Stanzbiopsien.
Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines einzigen floxed-verbrauchsteuerpflichtigen Lentivirusvektor konstitutiv exprimieren die 4 Faktoren. Frisch gesammelten oder aufgetaute PBMCs werden für 9 Tage wie beschrieben in Medium enthaltenden 10,11 Ascorbinsäure, SCF, IGF-1, IL-3 und EPO bevor es mit dem STEMCCA Lentivirus transduziert erweitert. Die Zellen werden dann auf MEFs ausplattiert und ESC-ähnliche Kolonien visualisiert werden kann 2 Wochen nach der Infektion. Schließlich werden selektierten Klone expandiert und auf die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81. Dieses Protokoll ist einfach, robust und sehr konsistente, eine zuverlässige Methode zur Herstellung von menschlichen IPSCs aus leicht zugänglichen 4 ml Blut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier die Verwendung des STEMCCA Lentivirusvektor die menschliche IPSCs aus mononukleären Zellen von einigen ml frisch gesammelten peripheren Blut isoliert erzeugen. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um gefrorene PBMCs (direkt aus dem Buffy-Coat) erhalten ein Detail erhebliche praktische Auswirkungen umzuprogrammieren bei der Nutzung Spenderzellen von einem entfernten Standort erworben werden. Vor der Induktion von Umprogrammierung muss isolierten PBMCs durchlaufen eine kritische Expansionsstufe,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studien wurden zum Teil durch NIH UO1HL107443-01 Award GJM und GM finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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