代人类诱导多能干细胞从外周血中使用STEMCCA慢病毒载体
Summary
这里，我们表明一个简单而有效的协议，用于从外周血3-4毫升，使用一个单一的慢病毒重新编程矢量代人类iPSCs。现成的血细胞重新编程的承诺，加快利用IPSC的技术，使其接触到更广泛的研究团体。
Abstract
通过四个转录因子，即Oct4，Klf4导入正常的异位表达，Sox2和cMyc，人的体细胞可以被转换到多能干状态，产生所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞）1-4。特定病人的iPS细胞缺乏的伦理问题，围绕胚胎干细胞（ES细胞），并会绕过可能的免疫排斥反应。因此，iPS细胞疾病模型研究，药效成分的筛选和再生疗法5，已经引起相当大的关注。
我们已经证实了代转基因人类iPSCs从不同的肺部疾病的患者使用一个单一的应纳税多顺反子慢干细胞盒式录音带（STEMCCA）的编码山因素6。这些的IPSC的线产生的皮肤成纤维细胞中，最常见的用于重新编程的细胞类型。通常情况下，获得成纤维细胞，需要皮肤活检冲头，然后通过细胞的膨胀秒，文化几段。更重要的是，若干组报道人外周血细胞的重新编程到iPSCs的7-9。在一项研究中，采用的TET诱导版本的STEMCCA载体9，这需要同时感染的血细胞组成性激活的慢病毒编码的逆四环素反式激活。与成纤维细胞，外周血细胞可以收集通过微创手术，大大减少了病人的不适和痛苦的。一个简单而有效的协议可能会加速血细胞重新编程的一个组成单应纳税载体IPSC的技术应用到更广泛的研究。此外，外周血细胞重新编程，允许从个人产生的iPS细胞在皮肤活检应该是可以避免的（ 即 。异常疤痕），或由于预先存在的疾病状况preventi纳克冲的活组织切片检查。
在这里，我们展示了一个协议，用于人类iPSCs从外周血单核细胞（PBMCs）使用一个单一的两侧装接loxP的消费税慢病毒载体的组成型表达的4个因子的产生。被用的STEMCCA慢病毒转导之前，新鲜收集的或解冻的外周血单个核细胞被扩展为9，10,11天的描述在介质中含有抗坏血酸，SCF，IGF-1，IL-3和EPO。然后将细胞培养皿上MEFs和感染两周后，可以可视化ESC样集落。最后，所选的克隆被扩展和测试的多能性干细胞标记SSEA-4，TRA-1-60和Tra-1-81的表达。该协议是简单的，鲁棒的和高度一致，提供了一个可靠的方法用于产生人类iPSCs从易于接触的4毫升血液。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在此描述的STEMCCA慢病毒载体的使用，以产生从几毫升的新鲜收集的外周血单核细胞分离的人类iPSCs。协议也可以用于利用从一个遥远的位置获得的供体细胞重编程冷冻的外周血单个核细胞（直接得自血沉棕黄层）时，显着的实际影响的细节的。分离的外周血单个核细胞重编程诱导前，必须经过一个关键的扩展步骤，使一个健康的增殖人口更适合核重编程的细胞。由'膨胀时在造血的培养条?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这些研究的部分经费由美国国立卫生研究院UO1HL107443-01奖，郭敬明和GM。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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