STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成
Summary
ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4 mlから人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。容易に入手可能な血液細胞の再プログラミングすることは、より広い研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSCの技術の利用を促進することを約束します。
Abstract
4つの転写因子の異所性発現は、あるOct4、Klf4の、Sox2、およびCMYCを通して、人間の体細胞は、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）1-4を生成し 、多能性状態に変換することができます。患者固有性IPSCは、胚性幹細胞（ESC）を囲む、可能な免疫拒絶を回避したい倫理的な問題を欠いている。したがって、性IPSCは疾患モデル研究、薬理学的化合物のスクリーニング、及び再生治療5のためのかなりの注目を集めている。
私たちは、山中因子6をコードする単一のポリシストロン切除可能レンチ幹細胞カセット（STEMCCA）を使用して異なる肺疾患の患者から導入遺伝子を含まない人間性IPSCの発生を示している。これらIPSC行は皮膚線維芽細胞、再プログラムのために使用される最も一般的な細胞型から生成された。通常は、線維芽細胞を得ることがパンチ生検、細胞の膨張が続く肌を必要とするいくつかの通路のための文化の中での。重要なのは、グループの数は性IPSC 7月9日にヒト末梢血細胞の再プログラム化を報告している。ある研究では、STEMCCAベクトルのTet誘導性バージョンが血液細胞を同時にリバーステトラサイクリントランスアクチベーターをコードして恒常的に活性なレンチウイルスに感染していることが必要とされ、9を採用した。線維芽細胞とは対照的に、末梢血細胞が大幅に患者の不快感や苦痛を減らし、低侵襲の手順を介して収集することができます。構成単切除可能ベクターを用いて血液細胞を再プログラミングするためのシンプルで効果的なプロトコルは、より広範な研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSC技術の応用を促進することがあります。さらに、末梢血細胞の再プログラミングすることは皮膚生検を回避すべきで個人からの性IPSCの生成ができるようになります（ すなわち 。瘢痕異常）または起因する既存の疾患状態preventiにパンチ生検にngのアクセス。
ここでは、構成的に4因子を発現する単一フロックス化、切除可能レンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞（PBMC）から人間性IPSCの世代のためのプロトコルを示しています。 STEMCCAレンチウイルスで形質導入される前を含む培地アスコルビン酸、SCFは、IGF-1、IL-3およびEPOの10,11に記載されているように採取直後または解凍PBMCは9日間に展開されます。次いで、細胞をMEFの上にプレーティングとESCのようなコロニーが2週間後に感染可視化することができる。最後に、選択されたクローンを増殖させ、多能性マーカーSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の発現のためにテストされています。このプロトコルは、血液の容易にアクセス可能な4ミリリットルから人間性IPSCの生成のための信頼性のある方法論を提供し、シンプル、堅牢で非常に一貫しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、ここたて採取した末梢血数ミリリットルから単離された単核細胞から人間性IPSCを生成するためにSTEMCCAレンチウイルスベクターの使用を記載している。遠い場所から取得されたドナー細胞を利用する際のプロトコルはまた、重要な実用的な含意の詳細（バフィーコートから直接取得した）凍結PBMCを再プログラムするために使用することができます。プログラミングの誘導前に、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの研究は、GJMとGMへのNIH UO1HL107443-01賞によって部分的に資金を供給した。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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