Orthotope Aorta Transplantatie in Muizen voor de Studie van vasculaire aandoeningen

Summary

We beschrijven een techniek waarbij een deel van de abdominale aorta van een muis getransplanteerd orthotopically is om net onder de nierslagaders in een allogene of syngene ontvanger. Deze techniek kan nuttig zijn in studies waarin transplantatie van grote slagaders van gelijke grootte is als voordelig.

Abstract

Vasculaire procedures waarbij anastomosen in de muis wordt algemeen gedacht moeilijk en sterk afhankelijk van de vaardigheid van de individuele chirurg. Dit geldt grotendeels, maar er zijn een aantal belangrijke principes die de moeilijkheidsgraad van deze procedures kan verminderen en reproduceerbaarheid. Orthotopische aorta transplantatie is een uitstekende procedure om deze principes leren omdat het alleen twee end-to-end anastomose, maar vereist een goede hechting techniek en behandeling van de vaartuigen verenigbaar succes. Deze procedure begint met het verkrijgen van een stuk abdominale aorta van een donordier, gevolgd door splitsing van het natieve aorta in de ontvanger. De verkregen aorta wordt dan geplaatst tussen de verdeelde uiteinden van de ontvanger en aorta gehecht vast met end-to-end anastomose. Om dit te bereiken doel met succes een hoge mate van concentratie, goed gereedschap, een vaste hand en een appreciatie van vereist hoe gemakkelijk devasculatuur van een muis kunnen worden beschadigd, waardoor trombose. Het leren van deze belangrijke principes is wat beslaat het grootste deel van de tijd de beginners bij het leren van microchirurgie bij kleine knaagdieren. Gedurende dit protocol, verwijzen we naar deze belangrijke punten. Dit model kan worden gebruikt om vasculaire ziekte te bestuderen in verschillende experimentele systemen ^1-8. In de context hier wordt meestal gebruikt voor de studie van post-transplantatie vaatziekten, een lange-termijn complicatie van een orgaantransplantatie waarin intimale hyperplasie optreedt in de allograft. Het belangrijkste voordeel van het model is dat het kwantitatieve morfometrische analyse vergemakkelijkt en het getransplanteerde vat ligt grenzend aan het endogene vat, dat kan dienen als extra controle ^9. De techniek hier wordt het meest gebruikt voor muizen met een gewicht 18 tot 25 gram. We hebben opgebouwd de meeste van onze ervaring in het gebruik van de C57BL/6J, BALB / CJ en C3H/HeJ stammen.

Protocol

1. Pre-operatieve voorbereiding

1. Chirurgische procedures, ongeacht hoe zorgvuldig gedaan, resulteren in significante stress. Om de effecten van een dergelijke belasting te minimaliseren en de reserves te maximaliseren, moeten de dieren worden gehandhaafd in het vivarium voor ten minste 72 uur voor gebruik ^10,11.
2. Chirurgische instrumenten, gaas, en swabs moeten steriel zijn. Het is niet nodig om steriele handschoen die slechts de uiteinden van de instrumenten aanraking hechting of het operatiegebied gebruiken.
3. Voor hemostase, is het noodzakelijk dat spankrachten zijn het noodzakelijke minimum. Schade aan het schip als gevolg van overmatige druk of ruwe behandeling zal leiden tot trombose, wat resulteert in achterpoot verlamming, darm ischemie, en de dood binnen 24 uur. We hebben gevonden dat met klemmen met een druk van niet meer dan 2 g / cm ² het probleem elimineert. Deze klemmen zijn vermeld in tabel 1. Clamp druk wordt aangegeven in de specificaties voor klemmen die door hoge kwaliteit chirurgische instrument fabrikanten. We hebben gevonden dat goedkoop klemmen of wegwerp klemmen algemeen teveel druk uitoefenen.
4. De locatie van de collaterale vaten en de relatieve locaties van de abdominale aorta en inferior vena cava (IVC) zijn afhankelijk stam. U vindt er ook kleine variaties tussen individuele muizen, vooral in de locatie van collaterale vaten.

2. Donor Operatie

1. Muizen worden verdoofd met isofluraan (1,5-2,5% inductie, 1,0% onderhoud in lucht) of met pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital legt een termijn (tot 1,5 uur), maar de chirurg de mogelijkheid roterende het dier betere toegang, indien gewenst. Anesthesie tijd kan worden verlengd tot 2 uur door het plaatsen 2-3 druppels van het verdovingsmiddel zo nodig op de darm of lever tijdens de operatie. Ketamine / xylazine (100 mg / kg lichaamsgewicht voor ketamine en 7 mg / kg voor Xylazine, ip) kan ook worden gebruikt door goed opgeleide chirurgen can eindigen de procedure binnen 1 tot 1,5 uur, maar heeft een smaller bereik veilige dosis. In de Verenigde Staten is het gebruik van pentobarbital problematischer geworden in de afgelopen jaren vanwege korte leveringen. Het is noodzakelijk dat de diepte van de anesthesie worden gecontroleerd om zeker te zijn dat het voldoende is. De teen-snuifje reflex is de beste indicator van voldoende diepte, maar men moet er ook rekening mee ademhaling en andere bewegingen.
2. Na anesthesie inductie, gebruik dan een ontharingscrème gel of een scheerapparaat om haar te verwijderen op de ventrale buik.
3. Monteer het dier op de operatietafel boord met behulp van laboratorium tape om het te houden in een gespreide armen en benen positie. Een metalen operating board is het gebruik van een verwarmingselement eronder op temperatuur ondersteuning tijdens de operatie. We handmatig de temperatuur van de verwarming pad, dat is een consument-grade-eenheid voor thuisgebruik. De temperatuur wordt tussen 35-38 °. De metalen operationele bestuur is ook gemakkelijk te steriliseren tussen de procedures.
4. Ontsmet het gebied met behulp van een ontsmettingsmiddel zoals chloorhexidine, gevolgd door een ethanol wassen. Herhaal deze procedure drie maal, om adequate desinfectie verzekeren. Dit verwijdert ook resterende stukjes gesneden haren, indien aanwezig.
5. Met behulp van een schaar een insnijding door het lichaam muur om de ingewanden van de buik bloot te leggen.
6. Gebruik een wattenstaafje, druk op de ingewanden aan de zijkant van de grote vaten van de buik bloot te leggen. De ingewanden worden op een gaasje dat bevochtigd met warm zoutoplossing om het vochtig te houden.
7. Met stompe dissectie, zorgvuldig ontleden de abdominale aorta verwijderd van het omringende weefsel. Wees zeer voorzichtig bij het ontleden van het schip uit de buurt van de vena cava inferior. Er zullen een of meer takken, zoals de lumbale arterie, die zorgvuldig moet worden opgeheven en dichtgeschroeid. Het gedeelte van ontleed aorta moet onder de renale bloedvaten en boven de bifurcatie van de aorta in de femorale slagaders. Deze sectie kan dienen als donor-materiaal voor zo velen eens twee ontvangers, afhankelijk van het aantal vertakkingen vaartuigen bestaan ​​en de omvang van het donordier.
8. Bind een hechting net onder de nierslagaders en een boven de bifurcatie. Met schaar verdelen de aorta, volledig spoel de graft met zoutoplossing dat 200 U / ml heparine. Heel voorzichtig bezit een uiteinde van het vat en de druppel zoutoplossing zodat loopt door het vat door de zwaartekracht. Laat geen luchtbellen lopen door het vat. Behandel de uiteinden van het vaartuig zo min mogelijk anders intima kan worden beschadigd waardoor later trombose. Verwijder het uit het veld en direct te plaatsen in een container van ijskoude zoutoplossing. Laat de donordier aan exsanguinate.

3. Ontvanger Operatie

1. Verdoven van het dier zoals hierboven en breng een ontharingsmiddel gel of gebruik een scheerapparaat om haar te verwijderen op de buik. Vlak voor de incisie we subcutaan een dosis buprenorfine toedienen bij 0,1 mg / kg om analgesie te stellen.
2. Monteer het dier op de operatietafel veld met behulp van laboratorium tape. Het dier moet worden gemonteerd op een warme operationele fase die zal helpen handhaven lichaamstemperatuur tijdens de operatie.
3. Breng gentamycine oogzalf om de ogen om te voorkomen dat uitdroogt.
4. Desinfecteren buik, gevolgd door een ethanol wash. Herhaal deze procedure drie maal, om adequate desinfectie verzekeren.
5. Controleer de geschiktheid van de anesthesie weer voordat u verder gaat met de volgende stap.
6. Maak een incisie door de huid en het lichaam muur in twee fasen, zorg dat u invloed op de weefsels eronder.
7. Plaats een spreider te houden van de incisie in de buik open. Richt de schroefsamenstel naar het achterste einde het grootste deel van de klem houden de weg.
8. Bevochtig een vierkant van steriel gaasje met zoutoplossing en plaats deze over de darmen. Met uw vinger zachtjes op het gaas, plaatst u een wattenstaafje onder de darmen en voorzichtig weerspiegelen de darmen naar de side dus ze zitten op de top van het gaas. Neem nog een stukje gaas, plaats het op de darmen en nat met zoutoplossing.
9. Verwijder vetweefsel voor de aorta en inferior vena cava (IVC). Wees voorzichtig. Het IVC is zeer broos.
10. Voorzichtig een tang om de infrarenale aorta van het IVC ontleden. Duidelijke groot genoeg is om ruimte te bieden voor twee klemmen voldoende vaartuig daartussen zodanig dat uitgesplitst, er genoeg vaartuig waarop het implantaat kan worden gehecht worden. Bij ontleden, kijk voor schip takken. Eventueel verharden ze met een lage temperatuur cauterizer.
11. Plaats een vasculaire klem net onder de nierarterie en een ander net boven de bifurcatie.
12. Snij de aorta. De uiteinden van de aorta gewoonlijk terugtrekken, waardoor een ruimte van ongeveer 5 mm. Controleer voor hemostase. Als de klemmen correct werken, moet slechts een kleine hoeveelheid bloed ontsnappen na het doorsnijden. Als de bloeding aanhoudt, controleert u de klemmen te zorgen dat er niets te zijn is storingIng met hen. Merk op dat geen van de aorta wordt verwijderd. Het is slechts verdeeld.
13. Spoel de gesneden uiteinden met gehepariniseerde zoutoplossing (200 U / ml) en verwijder de extra oplossing met een wattenstaafje.
14. Tack het transplantaat op zijn plaats met behulp van drie discontinue hechtingen aan elk uiteinde. Net hechten de ene kant van de anastomose aan elk uiteinde, en vul vervolgens de rest met een continu draaiende hechting of meer discontinue hechtingen. Zeven tot acht discontinue hechtingen voldoende. Als u een lopend hechtdraad, zorg ervoor dat de vaatwanden ontspannen blijven en dat je niet stenose veroorzaken op de anastomose.
15. Verwijder voorzichtig de klem aan het craniale uiteinde en kijk op lekkage bij de hechtdraad lijnen. Een kleine hoeveelheid kwel is OK mits het stopt binnen ongeveer een minuut. Als er meer dan is het mogelijk om een ​​enkele steek gebruiken om het bloeden te stoppen.
16. Druk zachtjes op de aorta boven de anastomose site met een bevochtigde katoenen applicator en verwijder de tweede klem. Druk voorzichtig op enlaat een paar keer en controleer of de aorta octrooi verschijnt. Het transplantaat wordt onmiddellijk geperfuseerd en een puls moet zichtbaar zijn.
17. Verwijder het gaasje voor de darmen en zet ze terug op hun plaats. Vermijd verdraaien van de darm en onderhouden van normale anatomische oriëntatie.
18. Sluit de spierlaag met behulp van 5-0 Vicryl.
19. Sluit de huid met behulp van 5-0 of 6-0 Prolene.
20. Subcutaan Behandel de muis met carprophen bij 5 mg / kg om analgesie te vergroten voordat het eindigt anesthesie.
21. Geef de muis 0,5-0,8 ml zoutoplossing subcutaan.
22. Plaats de muis in een verwarmde kooi te herstellen. Zorgvuldig te controleren dat tijdens het herstel zeker te zijn dat het normaal aan het herstellen is. 2-3 uur na de operatie moet de muis relatief normaal gedragen. Bij 12 uur na de operatie, het dier subcutaan te behandelen met buprenorfine bij 2 mg / kg analgesie. Indien op enig moment, het dier wordt gebogen, het maken van lawaai of vertonen een beperkt bereik van de beweging, het probleem onderzoeken. Indieneen definitieve oorzaak niet kan worden vastgesteld en bevestigd, moet het dier worden gedood per institutionele protocollen. Na 24 uur werd het dier moeten krijgen een dosis subcutaan carprophen bij 5 mg / kg. Achterbeen verlamming geeft een mislukte anastomose of een trombus. In deze situatie moet de dieren worden gedood.

Representative Results

Figuur 1 toont een aorta graft. De witte pijlen geven de hechtdraad lijnen. Een octrooi graft zal een zichtbare puls. Figuur 2 geeft een typisch experiment waarin ontvanger overleving gevolgd gedurende een periode van 56 dagen. Een groep bestond uit wild-type (C57BL / 6 x FVB) ontvangende muizen getransplanteerd met BALB / c aorta. De andere groep, aangeduid als "KO" bestaat uit ontvangers (C57BL / 6 x FVB) deficiënt in expressie van heme oxygenase-1, waardoor trombose van de transplantaten binnen 24 uur. Met name resulteert in de dood van alle ontvangers afgebeeld. Figuur 3 toont echometingen van de IVC en abdominale aorta in een normaal dier en in een transplantatie ontvanger. Merk op dat de ent octrooi en lijken op de niet-getransplanteerde aorta.

Figuur 1.Een mening van een getransplanteerde aorta. De witte pijlen geven de hechtdraad lijnen.

Figuur 2. Kaplan-Meier afbeeldingen van overleving na transplantatie aorta in twee groepen muizen getransplanteerd met aorta van een BALB / c muis. "KO" duidt ontvangers deficiënt in de expressie van heme oxygenase-1, waardoor trombose van de aorta grafts binnen 24-48 uur. "WT" wordt de wildtype nestgenoten. Overgenomen uit: Koolmonoxide redt heme oxygenase-1-deficiënte muizen van arteriële trombose bij allogene transplantatie aorta, Chen B, Guo L, Ventilator C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 met toestemming van Elsevier.

Figure 3. Echo beeldvorming van de inferior vena cava (IVC) en abdominale aorta in vivo in een normale muis (linker paneel) en in een aorta transplantatie ontvanger (rechter paneel). De beelden werden gemaakt met een Visualsonics Vevo 660 instrument. Sterretjes geven het lumen van de schepen.

Discussion

Muismodellen van aorta transplantatie een aantal voordelen omdat muizen goed immunogenetically ^9,12,13 gedefinieerd, en ze kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd om de expressie van specifieke genen te wijzigen, indien gewenst. Zoals vermeld in de inleiding, vaatchirurgie in de muis is moeilijker dan de meeste modellen vanwege de grootte van de schepen. Zelfs de grote slagaders, zoals de aorta gewoonlijk niet meer dan 100-200 iM in binnendiameter, zodat het manipuleren van deze schepen is een aanzienlijke hoeveelheid vaardigheid en handigheid ^8,14. De meest voorkomende complicatie waargenomen in deze operatie door die nog maar net begonnen om het systeem te implementeren is achterpoot verlamming, meestal veroorzaakt door trombose als gevolg van letsel van intima door ruwe behandeling of klemmen. De meeste klemmen verkocht door bedrijven die geschikt gereedschap verkopen voor microchirurgie die te veel druk wordt gebruikt voor muizen, bij drukken gewoonlijk hoger dan 25 g / cm ^2. De clas we gebruiken zijn glad, met een druk van 2 gm / cm ^2, een druk die net genoeg om hemostase en niet schadelijk voor de vaten. Sommige chirurgen de voorkeur aan hechtdraad gebruiken in plaats van klemmen. We raden deze praktijk, omdat het is een methode die sterk afhankelijk is van het vermogen van de chirurg om de juiste druk te meten en, naar onze mening, kan bijdragen aan een lager slagingspercentage. Met de praktijk, moet overleving van 90% of beter worden verwacht.

Hechten techniek voor de end-to-end anastomose is een cruciale vaardigheid die is opgedaan met ervaring. Afhankelijk van voorafgaande ervaring met chirurgische technieken en handvaardigheid, kan volledige beheersing worden bereikt na 50 tot 100 procedures. Meer recente studies suggereren alternatieve technologieën voor anastomosen beschikbaar kan komen in de toekomst ^15.

De belangrijkste beperking van deze procedure is, zoals de meeste microchirurgische procedures in muizen, dat een hoog niveau van vaardigheiddie nodig zijn voor een succesvolle uitvoering en personen die geen goede fijne motoriek kan nooit het bereiken van een hoog niveau van bekwaamheid. Echter, met de praktijk kunnen de meeste mensen bereiken een aanvaardbaar overlevingskans. De geringe omvang van de weefsels resulteert ook in extra beperkingen omdat de grootte van het implantaat is zeer klein, zodat de hoeveelheid materiaal voor verdere analyse beperkend. Het grootste voordeel van het model is de goed gekarakteriseerde Immunogenetica van muizen, de brede beschikbaarheid van talrijke inteeltstammen, transgene muizen en knockout muizen, waardoor zeer nuttig experimenten moleculaire mechanismen pakken in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240