Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van<em> Xenopus</em> Egg Extracten

Summary

Xenopus ei extract is een nuttig modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol is voor de bereiding van Xenopus ei extracten en DNA schade checkpoint inducerende reagentia. Deze technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van DNA beschadigende benaderingen in de studie van de DNA schade checkpoint signaling.

Abstract

Op een dagelijkse basis, worden cellen blootgesteld aan verschillende endogene en milieubeschadigingen. Om deze beledigingen bestrijden zijn cellen ontwikkeld DNA schade checkpoint signalering als een controlemechanisme om DNA schade en direct cellulaire responsen waarnemen op DNA schade. Er zijn verschillende groepen van eiwitten genaamd sensoren, transducers en effectors betrokken bij DNA schade checkpoint signalering (figuur 1). In dit complex signaalweg ATR (ATM en Rad3 gerelateerde) is een van de belangrijkste kinases die reageren op DNA schade en replicatie stress. Geactiveerde ATR kan fosforyleren haar downstream substraten zoals Chk1 (Checkpoint kinase 1). Bijgevolg gefosforyleerd en geactiveerd Chk1 leidt tot veel stroomafwaarts gelegen in de DNA schade checkpoint waaronder celcyclus, transcriptie activatie DNA schade herstel en apoptose of senescentie (figuur 1). Als DNA beschadigd is, niet aan de DNA-schade checkpoint resultaten te activeren in unrepuitgezonden schade en vervolgens genomische instabiliteit. De studie van de DNA schade checkpoint verduidelijken hoe cellen genomische integriteit en een beter begrip van menselijke ziekten, zoals kanker, te ontwikkelen.

Xenopus laevis ei extracten ontstaan ​​als krachtig celvrij extract modelsysteem DNA schade checkpoint onderzoek. Lage snelheid extract (LSE) werd aanvankelijk beschreven door de Masui groep ^1. De toevoeging van demembranated sperma chromatine te LSE resulteert in vorming kernen waar DNA wordt gerepliceerd in een semiconservatieve wijze eenmaal per celcyclus.

De ATR/Chk1-mediated checkpoint signaleringsroute wordt geactiveerd door DNA-schade of replicatie spanning ^2. Twee methoden worden momenteel gebruikt om de DNA schade veroorzaken checkpoint: DNA beschadigende benaderingen en DNA schade gelijkende structuren ^3. DNA schade kan worden veroorzaakt door ultraviolet (UV) bestraling, γ-straling, methyl methaanesulfonate (MMS), mitomycine C (MMC), 4-nitrochinoline-1-oxide (4-NQO) of aphidicoline ^{3, 4.} MMS is een alkylerende stof die DNA-replicatie remt en activeert de ATR/Chk1-mediated DNA-schade checkpoint ^4-7. UV bestraling activeert ook ATR/Chk1-dependent DNA schade checkpoint ^8. De DNA schade gelijkende structuur AT70 is gegloeide complex van twee oligonucleotiden poly-(dA) 70 en poly-(dT) 70. De AT70-systeem is ontwikkeld in het laboratorium van Bill Dunphy's en wordt veel gebruikt om ^negen-twaalf veroorzaken ATR/Chk1 checkpoint signalering.

We beschrijven protocollen (1) celvrije extracten ei (LSE) te bereiden, (2) Xenopus sperma chromatine behandelen met twee verschillende DNA beschadigen benaderingen (MMS en UV), (3) de DNA schade gelijkende structuur bereiden AT70, en (4) de ATR/Chk1-mediated DNA schade veroorzaken ijkpunt in LSE met beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur.

Protocol

1. LSE Voorbereiding Vrouw kikkers (Xenopus laevis) worden twee keer geïnjecteerd voor eieren ophalen. De eerste injectie (priming) is 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) per kikker. Kikkers moet worden voorbehandeld ten minste twee dagen voor de inducerende leggen van eieren en gegrond kikkers zijn bruikbaar voor maximaal twee weken. Om prime kikkers, injecteren PMSG subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 3 ml spuit en 27 G-naald. Om eieren leggen te induceren, …

Discussion

Er zijn verschillende voordelen bij het ​​bestuderen van DNA schade checkpoint met Xenopus ei extracten. Het gebruik van ei extracten biedt een grote hoeveelheid celvrije extracten gesynchroniseerd interfase van de celcyclus. Het ei extracten gemakkelijk en goedkoop worden gemaakt. Het is relatief eenvoudig aan DNA of chromatine beschadigen en een defect in de DNA schade checkpoint blijkt na immunodepleting een doeleiwit uit ei extract. Vervolgens kan een potentiaalfunctie defect worden "gered" do…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.