Etude de l'ADN à l'aide de Checkpoint dommages<em> Xenopus</emExtraits d'oeufs>

Summary

Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d'extraits d'œufs de xénope et de l'ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d'approches endommageant l'ADN dans l'étude de la signalisation checkpoint dommages de l'ADN.

Abstract

Sur une base quotidienne, les cellules sont soumises à une variété d'insultes endogènes et environnementaux. Pour lutter contre ces insultes, les cellules ont évolué checkpoint dommages à l'ADN de signalisation comme un mécanisme de surveillance afin de détecter les dommages de l'ADN et directs réponses cellulaires aux dommages à l'ADN. Il ya plusieurs groupes de protéines appelés capteurs, transducteurs et des effecteurs impliqués dans la signalisation checkpoint dommages de l'ADN (figure 1). Dans cette voie de signalisation complexe, ATR (ATM et Rad3 liée) est l'un des principaux kinases qui peuvent répondre aux dommages à l'ADN et le stress de réplication. Activé ATR peut phosphoryler ses substrats en aval tels que Chk1 (Checkpoint kinase 1). Par conséquent, phosphorylée et activée Chk1 conduit à de nombreux effets en aval sur le check-point dommages à l'ADN, y compris l'arrêt du cycle cellulaire, activation de la transcription, réparation de l'ADN et l'apoptose ou la sénescence (Figure 1). Lorsque l'ADN est endommagé, ne pas activer les dommages à l'ADN des résultats de points de contrôle dans unrepdommages aéré et, par la suite, l'instabilité génomique. L'étude du point de contrôle dommages à l'ADN permettront d'élucider comment les cellules de maintenir l'intégrité du génome et de fournir une meilleure compréhension de la façon dont les maladies humaines telles que le cancer, se développer.

Xenopus laevis extraits d'œufs sont en train de devenir un puissant système acellulaire modèle extrait dans la recherche checkpoint dommages de l'ADN. À basse vitesse extrait (LSE) a été initialement décrite par le groupe Masui ^1. L'ajout de la chromatine des spermatozoïdes demembranated aux résultats LSE dans la formation des noyaux où l'ADN est répliqué de façon semiconservative une fois par cycle cellulaire.

La voie de signalisation ATR/Chk1-mediated point de contrôle est déclenché par lésions de l'ADN ou ² stress réplicatif. Deux méthodes sont actuellement utilisées pour induire le point de contrôle de dommages à l'ADN: approches endommageant l'ADN et l'ADN des dommages imitant les structures ^3. Altération de l'ADN peut être induite par les rayons ultraviolets (UV), γ-irradiation, méthyle méthaneesulfonate (MMS), la mitomycine C (MMC), 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4-NQO), ou aphidicoline ^{3, 4.} MMS est un agent alkylant qui inhibe la réplication de l'ADN et active le point de contrôle des dommages l'ADN ATR/Chk1-mediated ^4-7. Irradiation UV déclenche également la ⁸ ADN ATR/Chk1-dependent dommages checkpoint. L'ADN des dommages-imitant la structure AT70 est un complexe recuit de deux oligonucléotides poly-(dA) 70 et le poly-(dT) 70. Le système AT70 a été développé dans le laboratoire Bill Dunphy et est largement utilisé pour induire ATR/Chk1 signalisation aux points de contrôle ^9-12.

Ici, nous décrivons les protocoles (1) pour préparer des extraits d'œufs exempts de cellules (LSE), (2) pour traiter la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus avec deux ADN différents endommager les approches (MMS et UV), (3) pour préparer l'ADN des dommages imitant la structure AT70, et (4) pour déclencher le point de contrôle des dommages dans l'ADN ATR/Chk1-mediated LSE avec la chromatine de sperme endommagé ou un dommage d'ADN-imitant la structure.

Protocol

1. Préparation LSE Grenouilles femelles (Xenopus laevis) sont injectées deux fois pour la collecte des œufs. La première injection (amorçage) est de 100 U PMSG (gonadotrophine sérique de jument gravide) par grenouille. Grenouilles doit être amorcée au moins deux jours avant d'œuf induisant la ponte et les grenouilles apprêtées sont utilisables jusqu'à deux semaines. Pour les grenouilles premiers, injecter PMSG voie sous-cutanée dans les sacs lymphatiques dorsaux en utilisant une …

Discussion

Il ya plusieurs avantages à étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN en utilisant Xenopus extraits d'œufs. L'utilisation d'extraits d'oeufs fournit une grande quantité d'extraits exempts de cellules synchronisées en interphase du cycle cellulaire. Les extraits d'oeufs peuvent être facilement et économiquement faite. Il est relativement facile à endommager l'ADN ou de la chromatine et de révéler un défaut dans le poste de contrôle de dommages de l'ADN apr…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.