Studio del danno al DNA con Checkpoint<em> Xenopus</em> Uovo Estratti
Summary
Xenopus uovo estratto è un sistema modello utile per studiare il punto di controllo danno al DNA. Questo protocollo è per la preparazione di estratti di uova di Xenopus e danno del DNA reagenti inducenti checkpoint. Queste tecniche sono adattabili ad una varietà di approcci di danneggiamento del DNA nello studio del DNA segnalazione checkpoint danni.
Abstract
Su base giornaliera, le cellule vengono sottoposte ad una serie di insulti endogeni e ambientali. Per combattere questi insulti, le cellule si sono evoluti danno checkpoint del DNA segnalazione come un meccanismo di sorveglianza per rilevare danni al DNA e dirette risposte cellulari al danno al DNA. Ci sono diversi gruppi di proteine chiamate sensori, trasduttori ed effettori coinvolti nella segnalazione checkpoint danni al DNA (Figura 1). In questo complesso percorso di segnalazione, ATR (ATM e RAD3 correlato) è uno dei principali chinasi che può rispondere al danno del DNA e stress replicazione. Attivato ATR può fosforilare i suoi substrati a valle, come Chk1 (Checkpoint chinasi 1). Di conseguenza, fosforilata e attivata Chk1 porta a molti effetti a valle nel checkpoint danno del DNA compresi arresto del ciclo cellulare, l'attivazione della trascrizione, danni riparazione del DNA, e apoptosi o senescenza (Figura 1). Quando il DNA è danneggiato, non riuscendo ad attivare i risultati danno checkpoint del DNA in unrepdanni in onda e, successivamente, instabilità genomica. Lo studio del punto di controllo danno al DNA chiariranno come le cellule di mantenere l'integrità genomica e fornire una migliore comprensione di come malattie umane, quali il cancro, lo sviluppo.
Xenopus laevis estratti di uova stanno emergendo come un potente sistema acellulare modello estratto nella ricerca checkpoint danni al DNA. A bassa velocità estratto (LSE) è stato inizialmente descritto dal gruppo Masui 1. L'aggiunta di cromatina spermatica demembranated ai risultati LSE in formazione nuclei dove viene replicato DNA in maniera semiconservativa volta per ciclo cellulare.
La via di segnalazione ATR/Chk1-mediated checkpoint viene attivata da danni al DNA o stress replica 2. Due metodi sono attualmente utilizzati per indurre il checkpoint danno al DNA: approcci che danneggiano il DNA e il DNA danni che imitano le strutture 3. Danno al DNA può essere indotta da raggi ultravioletti (UV) di irradiazione, γ-irradiazione, metil metanoesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitrochinolina-1-ossido di (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS è un agente alchilante che inibisce la replicazione del DNA e attiva il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA 4-7. Irradiazione UV innesca anche il danno ATR/Chk1-dependent 8 checkpoint del DNA. Il danno che imitano la struttura del DNA AT70 è un complesso di due oligonucleotidi ricotto-poli (dA) 70 e poli-(dT) 70. AT70 Il sistema è stato sviluppato nel laboratorio di Bill Dunphy ed è ampiamente utilizzato per indurre ATR/Chk1 segnalazione checkpoint 9-12.
Qui, descriviamo protocolli (1) per preparare estratti privi di cellule uovo (LSE), (2) per il trattamento di cromatina spermatica Xenopus con due DNA diversi approcci di danneggiare (MMS e UV), (3) per preparare il danno-imitazione struttura del DNA AT70, e (4) per attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA in LSE con cromatina sperma danneggiato o un danno che imitano la struttura del DNA.
Protocol
Discussion
Ci sono diversi vantaggi nello studio il punto di controllo danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. L'uso di estratti di uova fornisce una grande quantità di estratti acellulari sincronizzati al interfase del ciclo cellulare. Gli estratti uovo può essere facilmente ed economicamente realizzato. È relativamente facile danneggiare il DNA o cromatina e per rivelare un difetto del checkpoint danno al DNA dopo immunodepleting una proteina bersaglio estratto da uovo. Successivamente, un difetto d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto in parte con fondi forniti da The University of North Carolina a Charlotte, Wachovia fondo di base per eccellenza della facoltà, e una borsa di studio NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |
Referências
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