Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
La malattia cardiovascolare resta la principale causa di morte nel mondo 1. Ingegneria tissutale cardiaca molto promettente per fornire scoperte mediche rivoluzionarie con gli obiettivi di sviluppo di tessuti funzionali per la rigenerazione cardiaca, così come test di screening in vitro. Tuttavia, la capacità di creare modelli ad alta fedeltà di tessuto cardiaco è rivelato difficile. Matrice extracellulare del cuore (ECM) è una struttura complessa costituita da entrambi i segnali biochimici e biomeccanici che vanno dalla micro-alla scala nanometrica 2. Locali condizioni di carico meccanico e le interazioni cellula-ECM sono stati recentemente riconosciuti come componenti vitali in ingegneria del tessuto cardiaco 3-5.
Una gran parte della ECM cardiaco è composto da fibre di collagene allineate con diametri scala nanometrica che influenza significativamente l'architettura dei tessuti e accoppiamento elettromeccanico 2. Purtroppo, alcuni metodi have stato in grado di mimare l'organizzazione delle fibre ECM fino alla scala nanometrica. Recenti progressi nelle tecniche di nanofabbricazione, tuttavia, hanno permesso la progettazione e la realizzazione di ponteggi scalabili che imitano i segnali vivo rigidità strutturali e substrato della ECM nel cuore 6-9.
Presentiamo qui lo sviluppo di due riproducibile, processi nanopatterning scalabili per l'allineamento funzionale delle cellule cardiache utilizzando la poli polimero biocompatibile (lattide-co-glicolico) (PLGA) 8 e un poliuretano (PU) polimero a base conveniente, e. Questi substrati anisotropicamente nanofabricated (ANF) imitare la ECM sottostante ben organizzate, tessuti allineati e può essere utilizzato per studiare il ruolo di nanotopography sulla morfologia e la funzione delle cellule 10-14.
Utilizzando un nanostrutturati (NP) maestro di silicio come un modello, un acrilato di poliuretano (PUA) muffa è fabbricato. Questo stampo PUA viene quindi utilizzato per pattern l'idrogel PU o PLGA tramite solventi mediata litografia forza capillare (CFL)-UV assistita o, rispettivamente, 15,16. In breve, PU o PLGA pre-polimero è caduta erogato su un vetrino di vetro e lo stampo PUA è posto sulla parte superiore. Per CFL-UV assistita, il PU viene poi esposto a radiazioni UV (λ = 250-400 nm) per la polimerizzazione. Per mediata solvente CFL, il PLGA viene stampato mediante calore (120 ° C) e pressione (100 kPa). Dopo la polimerizzazione, lo stampo PUA è staccata, lasciando dietro un ANF per coltura cellulare. Pile, come neonatali miociti ventricolari di ratto, così come cardiomiociti derivati dalle cellule staminali umane pluripotenti, possono essere mantenuti in ANF 2.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo e presentare un pesante fardello socio-economico su un già tesa globale 1,17 sistema sanitario. Ingegneria tissutale cardiaca ha due obiettivi distinti: (1) per rigenerare il miocardio danneggiato dopo la malattia ischemica o cardiomiopatia o (2) per creare un modello ad alta fedeltà del cuore per lo screening in vitro di droga o di modellazione malattia.
Il cuore è un organo complesso che deve lavorare costantemente per la fornitura di sangue al corpo. Strutture laminari densamente di cardiomiociti e tessuti di sostegno sono disposti in schemi elicoidali tutta la parete cardiaca 18,19. Il cuore è anche accoppiato elettromeccanico 20 in un modo altamente coordinato per espellere efficacemente sangue al corpo 21. Diversi ostacoli principali restano da affrontare, tuttavia, prima intricato disegno della natura può attendibilmente essere ricapitolato in vitro.In primo luogo, anche se robusti metodi di differenziazione dei cardiomiociti continuano ad essere sviluppato 22, HPSC-CM esporre ancora fenotipi piuttosto immaturi. Le loro proprietà elettromeccaniche e la morfologia più strettamente corrispondono livelli fetali 23. In secondo luogo, se tenuto in condizioni di coltura tradizionali, sia derivato dalle cellule staminali e cardiomiociti primari non riescono ad assemblare in strutture native, tessuto-like. Piuttosto, le cellule diventano orientati in modo casuale e non presentano l'aspetto a forma di bastoncino fasciato di miocardio adulto 24.
La matrice (ECM) ambiente extracellulare con cui le cellule interagiscono gioca un ruolo importante in numerosi processi cellulari 11,13,25. L'ECM consiste di complessi segnali molecolari e topografici, ben definiti che influenzano significativamente la struttura e la funzione delle cellule 6,26. All'interno del cuore, l'allineamento cellulare segue da vicino le fibre ECM sottostante scala nanometrica 2. L'impatto di questi nanotopographspunti iCal sul cellulare e la funzione del tessuto, tuttavia, è ben lungi dall'essere completamente capito. Studi preliminari di interazione cellula-biomateriale scala nanometrica indicano la potenziale importanza e l'impatto di sub-micron spunti topografici per la segnalazione cellulare 27, 28-30 adesione, la crescita del 31, e la differenziazione 32,33. Tuttavia, a causa della difficoltà di sviluppare substrati nanofabricated riproducibili e scalabile, tali studi potrebbero non riprodurre gli effetti cellulari multi-scala del complesso de ambiente ECM vivo. In questo protocollo, una tecnica di nanofabbricazione semplice e conveniente per produrre scaffold di coltura cellulare che mimano allineamento delle fibre ECM cardiaca nativa è descritto, consentendo una vasta gamma di nuove ricerche di interazioni cardiomiociti-biomateriale. Capire come cardiomiociti interagiscono con l'ambiente ECM nanoscala potrebbe consentire per la capacità di controllare il comportamento cellulare per imitare più da vicino funzioni tessuto nativozione. Inoltre, monostrati cellulari sono un sistema sperimentale semplificato rispetto a strutture 3D, ma ancora presentano un comportamento multicellulare complesso per le indagini penetranti e screening funzionale 2,34-36. Infine, tali impalcature potrebbero essere utilizzati per migliorare la funzione del trapianto cellulare quando impiantato nel cuore per fini rigenerativi 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tessuti cardiaci funzionalmente maturi sono carenti sia in vivo che in vitro applicazioni di ingegneria tissutale cardiaco. I metodi di nanofabbricazione CFL qui descritte sono tecniche robuste per realizzare l'allineamento cellulare e influenzare la funzione del tessuto macroscopico dovuto alla scalabilità del sistema. Grandi aree possono essere facilmente modellati e utilizzati per la coltura cellulare. Macroscopico allineamento cellulare è essenziale in ingegneria tessuto cardiaco per creare biomimetic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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