Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смертности во всем мире 1. Сердечная тканевой инженерии является многообещающим для доставки новаторских медицинских открытий с целями развития функциональных тканей для регенерации сердца, а также в пробирке скрининга. Тем не менее, возможность создания весьма четких моделей ткани сердца оказалось трудно. Внеклеточный матрикс сердца (ECM) представляет собой сложную структуру, состоящую из двух биохимических и биомеханических сигналов, начиная от микро-к нанометровом масштабе 2. Часовой условия механической нагрузки и клеточной ECM взаимодействия недавно был признан жизненно важных компонентов в тканевой инженерии 3-5 сердечной.
Большая часть сердечной ECM состоит из выровненных волокон коллагена с нано-диаметров, что значительно влияет архитектуру ткани и электромеханической связи 2. К сожалению, несколько методов ВГАэ смогли имитировать организацию ECM волокон до нанометровом масштабе. Последние достижения в области методов нанофабрикации, однако, позволили проектирование и изготовление масштабируемых лесов, которые имитируют в естественных условиях структурных и подложки жесткости репликами ЕСМ в центре 6-9.
Здесь мы представляем развитие двух воспроизводимым, экономически эффективной, и масштабируемые процессы Nanopatterning для функционального выравнивания сердечных клеток с использованием биосовместимого полимера поли (лактид-гликолида) (PLGA) 8 и полиуретана (PU) на основе полимера. Эти анизотропно nanofabricated субстраты (ANFS) имитировать основной ECM хорошо организованных, выстроенных тканей и может быть использован для исследования роли nanotopography на морфологию и функцию 10-14 клеток.
Использование наноструктурированных (НП) мастер кремния в качестве шаблона, полиуретан-акриловой кислоты (PUA) форма сфабрикованы. Это PUA плесень затем используется для годовыхttern гидрогель PU или PLGA через УФ-помощь или растворителя-опосредованной капиллярной силы литографии (CFL), соответственно 15,16. Вкратце, PU или PLGA форполимер является падение обойтись на покровным стеклом и форма PUA помещают сверху. Для УФ-помощь CFL, ПУ затем подвергают воздействию УФ-излучения (λ = 250-400 нм) для лечения. Для растворителя-опосредованной CFL, PLGA тиснением с использованием тепла (120 ° C) и давлении (100 кПа). После отверждения, форма PUA отслаивается, оставляя позади ANFS для культивирования клеток. Первичные клетки, такие как новорожденных крыс желудочковых миоцитов, а также плюрипотентных клеток кардиомиоцитов, полученных стволовых человека, может поддерживаться на ANFS 2.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в мире и представить весомый социально-экономическое бремя на уже напряженным глобальной системы здравоохранения 1,17. Сердечная тканевая инженерия имеет два различных целей: (1) регенерировать поврежденную миокарда после ишемической болезни или кардиомиопатии или (2) для создания высокой точностью модель сердца для экстракорпорального скрининга лекарственных средств или моделирования заболевания.
Сердце представляет собой сложный орган, который должен работать постоянно поставлять кровь к телу. Плотно упакованные ламинарные структуры кардиомиоцитов и поддерживающих тканей расположены в спиральных узоров всей сердечной стенки 18,19. Сердце также электромеханическим в сочетании 20 в высоко скоординированным образом, чтобы эффективно при извлечении крови в организме 21. Несколько крупных препятствия остаются нерешенными, однако, прежде чем сложный дизайн природы можно надежно воспроизводятся в пробирке.Во-первых, хотя надежные методы кардиомиоцитов дифференциации продолжают разрабатываться 22, HPSC-КМ-прежнему демонстрируют довольно незрелых фенотипы. Их электромеханические свойства и морфология наиболее близко соответствуют уровни плода 23. Во-вторых, когда, содержащихся в традиционных условиях культивирования, как стволовых клеток, полученных и первичные кардиомиоциты не в состоянии собрать в родные, ткани-подобных структур. Напротив, клетки становятся ориентированы случайным образом и не проявляют полосчатой форме стержня внешний вид взрослого миокарда 24.
Внеклеточного матрикса (ECM) среда, с которой взаимодействуют клетки играет важную роль во многих клеточных процессах 11,13,25. ЕСМ состоит из сложных, четко определенных молекулярных и топографических сигналы, которые значительно влияют на структуру и функцию клеток 6,26. В самом центре, сотовой выравнивание внимательно следит за основной нанометровом масштабе ECM волокна 2. Воздействие этих nanotopographческих сигналы на клетки и функции ткани, однако, далеко не полностью изучены. Предварительные исследования клеток-биоматериал взаимодействия нанометрового масштаба, указывают на потенциальную важность и влияние субмикронных топографических киев для ячейки сигнализации 27, адгезии 28-30, рост 31 и дифференциации 32,33. Тем не менее, в связи с трудностью в разработке воспроизводимые и масштабируемые nanofabricated субстраты, такие исследования не могли воспроизвести несколько масштабных клеточные эффекты в комплекса в естественных условиях окружающей среды ECM. В этом протоколе, простой и экономически эффективный метод нанофабрикации производить клеточных культур строительные леса, имитирующие родной выравнивание сердечной ECM волокна описывается, что позволяет для широкого круга новых исследований кардиомиоцитов биоматериал взаимодействий. Понимание того, как кардиомиоциты взаимодействовать с наноразмерными ECM среды может позволить для способности контролировать клеточный поведение более точно имитировать родной ткани функцийТион. Кроме того, клеточные монослои являются упрощенная экспериментальная система по сравнению с 3D структур, но все еще демонстрируют сложную многоклеточных поведение для проницательных исследований и функциональной скрининга 2,34-36. Наконец, такие каркасы могут быть использованы для улучшения клеточной функции трансплантата при имплантации в сердце для восстановительных целей 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Функционально зрелые сердечные ткани не хватает для как в естественных условиях и в приложениях пробирке тканевой инженерии сердечной. Методы Nanofabrication CFL, описанные здесь, надежные методы для достижения сотовой выравнивание и влиять функцию макроскопического тканей из-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Referências
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
