In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında ölüm 1'in önde gelen nedenidir. Kardiyak doku mühendisliği kalp rejenerasyonu hem de in vitro tarama deneyleri için fonksiyonel doku geliştirme amaçları çığır açan tıbbi keşifler sunmak için çok umut vermektedir. Ancak kalp dokusunun yüksek sadakat modelleri oluşturmak için yeteneği zor kanıtlamıştır. Kalbin hücre dışı matris (ECM) nanometre ölçeğinde 2 mikro-değişen hem de biyokimyasal ve biyomekanik sinyallerin oluşan karmaşık bir yapıdır. Mekanik yükleme koşulları ve hücre-ECM etkileşimleri Yerel son zamanlarda kalp doku mühendisliği 3-5 hayati bileşenleri olarak kabul edilmiştir.
Kardiyak ECM büyük bir kısmı bir doku mimarisi ve elektrik kuplajı 2 etkiler nano ölçekli çapları ile uyumlu kolajen liflerinin oluşmaktadır. Ne yazık ki, birkaç yöntem have nanometre ölçeğinde aşağı ECM liflerin organizasyonunu taklit etmek mümkün olmuştur. Nano sentezleme teknikleri son gelişmeler, ancak, kalp 6-9 ECM'nin in vivo yapısal ve alt-tabaka sertliği ipuçları taklit ölçeklenebilir iskelelerinin tasarım ve imalat sağlamıştır.
Burada gelişimini mevcut iki tekrar üretilebilir, düşük maliyetli ve biyo uyumlu polimer, poli (laktid-ko-glikolid) (PLGA) 8 ve bir poliüretan (PU) bazlı bir polimer kullanılarak kalp hücrelerinin işlevsel uyum için ölçeklenebilir nanopatterning işlemleri. Bu izotropik nanofabricated katmanlarından (ANFS) iyi organize, hizalanmış dokuların yatan ECM taklit ve hücre morfolojisi ve fonksiyonu 10-14 nanotopography rolünü araştırmak için kullanılabilir.
Bir şablon olarak nano tel (NP) silikon ana kullanarak, poliüretanakrilat (PUA) kalıp imal edilir. Bu PUA kalıp daha sonra pa için kullanılırsırasıyla UV-destekli veya solvent-aracılı kılcal kuvvet litografi (CFL), 15,16 yoluyla PU veya PLGA hidrojel ttern. Kısaca, poliüretan ya da PLGA ön-polimer, bir cam lamel ve PUA kalıp üzerine yerleştirilir üzerine uygulanan damladır. UV destekli cfl için, PU sonra tedavi için UV radyasyonu (λ = 250-400 nm) maruz kalır. , Çözücünün aracılık ettiği cfl için, PLGA ısı (120 ° C) ve basınçta (100 kPa) ile kabartılır. Sertleştirme sonrası, PUA kalıp hücre kültürü için bir ANFS geride bırakarak sıyrılır. Bu tür neonatal sıçan ventriküler miyositlerde, hem de insan pluripotent kök hücre-türevi kardiyomiyositlerde Birincil hücreler, ANFS 2 üzerinde korunabilir.
Kardiyovasküler hastalık dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve zaten gergin küresel sağlık sistemi, 1,17 üzerinde ağır bir sosyo-ekonomik yükü sunuyoruz. (1) iskemik hastalık veya kardiyomiyopati sonra hasarlı miyokard yeniden veya (2) in vitro ilaç taraması veya hastalık modelleme için kalbin yüksek bir sadakat modeli oluşturmak için: Kardiyak doku mühendisliği iki ayrı hedefleri var.
Kalp vücuda kan sağlamak için sürekli çalışmak gerekir karmaşık bir organdır. Kardiyomiyositlerde ve destekleyici dokuların yoğun şekilde paketlenmiş laminar yapılar kalp duvarı 18,19 boyunca sarmal şablonlara göre düzenlenir. Kalp, aynı zamanda etkin bir şekilde elektro gövdesi 21'e kanı çıkarmak için yüksek koordineli bir şekilde 20 bağlanmıştır. Doğanın karmaşık tasarım güvenilir vitro değinmeyecek önce birkaç önemli engeller, ancak, ele alınması gerekmektedir.Sağlam kardiyomyosit farklılaşma yöntemleri 22 geliştirilmeye devam ediyor olmasına rağmen ilk, hPSC-CMs hala oldukça olgunlaşmamış fenotipleri gösterirler. Onların elektromekanik özellikleri ve morfolojisi en yakından fetal seviyeleri 23 maç. Geleneksel kültür koşullarında muhafaza İkincisi, kök hücre-türevi ve primer kardiyomiyositlerde hem doğal, doku benzeri yapılar halinde birleştirmek için başarısız. Bunun yerine hücreler, rasgele yönelimli olmak ve yetişkin miyokard 24'ün bantlı çubuk-şekilli bir görünüm göstermezler.
Hücrelerin etkileşim ile hücre dışı matris (ECM) ortamında çok sayıda hücresel süreçleri 11,13,25 önemli bir rol oynamaktadır. ECM önemli hücre 6,26 yapısını ve işlevini etkileyen karmaşık, iyi tanımlanmış moleküler ve topografik ipuçlarının oluşur. Kalp içinde, hücresel hizalama yakından yatan nanometre ölçekli ECM lifleri 2. izler. Bu nanotopograph etkisihücre ve doku işlevini üzerinde iCal ipuçları, ancak, uzak tamamen anlaşılmış değil. Nanometre ölçekli hücre-biyomateryal etkileşimi ön çalışmalar, 27 sinyalizasyon hücre, yapışma 28-30, büyüme, 31 ve farklılaşma 32,33 sub-mikron topografik ipuçlarının potansiyel önemini ve etkisini gösterir. Ancak, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir nanofabricated substratlar gelişmekte zorluk, bu tür çalışmalar, in vivo ECM ortamda kompleksinin çok ölçekli hücresel etkilerini yeniden olamazdı. Bu protokol, doğal kardiyak ECM fiber hizalama taklit eden hücre kültür yapı iskelesi üretmek için basit ve düşük maliyetli bir teknik nanofabrication kardiyomiyosit-biyomalzeme etkileşimlerinin yeni araştırmalar geniş bir yelpazede sağlayan, tarif edilmektedir. Kardiyomiyositler nano ECM çevre ile etkileşim nasıl anlamak daha yakından taklit yerli doku fonksiyon hücresel davranışını kontrol yeteneği için izin verebilirtion. Bundan başka, hücre tekli-tabakaları 3D yapıları ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiş bir deneysel sistem ama yine de anlaşılır araştırma ve fonksiyonel tarama 2,34-36 için karmaşık çok-hücresel davranışı sergiler. Son olarak, iskeleler rejeneratif amaçlı 37 için kalp içine implante zaman hücresel greft fonksiyonunu artırmak için kullanılan olabilir.
Fonksiyonel olgun kardiyak dokular in vivo ve kardiyak doku mühendisliği in vitro uygulamalarda hem eksiktir. Burada anlatılan CFL Nanofabrikasyona yöntemler hücresel uyumun sağlanması nedeniyle sistemin ölçeklenebilirlik makroskopik doku işlevini etkilemek için güçlü teknikler vardır. Büyük alanlar kolayca desenli ve hücre kültürü için de kullanılabilir. Makroskopik hücresel hizalama biomimetic, o miyokardın 38 mekanik ve elektrik hem özelliklerini etkiler gibi fon…
The authors have nothing to disclose.
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
Soft Rubber Roller | Speedball | ||
Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
Hot Plate | Corning | PC-420D | |
Sonicator | Branson | B2510MTH |