Os ratinhos transgénicos ou vectores virais têm sido utilizados para aumentar a expressão de proteína dentro do pulmão. No entanto, estas técnicas são demoradas e tecnicamente desafiante e têm efeitos fora do alvo, que pode confundir os resultados. O protocolo de transfecção de proteínas utiliza um reagente de transfecção à base de lipidos e uma microsprayer ultrafina para entregar uniformemente proteína activa a células do pulmão.
O aumento da expressão da proteína permite aos pesquisadores entender melhor o papel funcional desta proteína na regulação de processos biológicos fundamentais 1. No pulmão, isto foi conseguido tipicamente através de abordagens genéticas que utilizam ratinhos transgénicos 2,3 ou vectores virais ou não virais, que elevam os níveis de proteínas por meio de aumento da expressão do gene 4. Os ratinhos transgénicos são dispendiosas e demoradas para a geração e a inserção aleatória de um gene de expressão do transgene ou crónica pode alterar o desenvolvimento normal dos pulmões e, portanto, limitar a utilidade do modelo de cinco. Enquanto transgénicos condicionais evitam os problemas associados com a expressão do gene crónica 6, os transactivador (rtTA) tetraciclina ratinhos controlados reversa, que são utilizados para gerar a expressão condicional, desenvolver espontânea alargamento espaço de ar 7. Tal como acontece com transgénicos, a utilização de vectores virais e não virais é caro 8 e pode provocar a dose drespostas inflamatórias ependent que confundem os resultados 9 e dificultar a expressão 10. Além disso, a eficácia de doses repetidas são limitados por respostas imunes reforçadas ao vetor de 11,12. Pesquisadores estão desenvolvendo adeno-associado vetores virais (AAV) que provocam menos inflamação e têm mais expressão dentro do pulmão 13.
Usando β-galactosidase, apresentamos um processo para o aumento da expressão de proteínas rápida e eficazmente dentro do pulmão, usando uma técnica de transfecção directa de proteínas. Este protocolo de mistura uma quantidade fixa de proteína purificada com 20 ul de um reagente de transfecção à base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir a penetração no próprio tecido do pulmão. A mistura de proteína lipossomal é então injectado para dentro dos pulmões dos ratos através da traqueia usando uma microsprayer (Penn Century, Filadélfia, PA). O microsprayer gera uma multa nuvem de aerossol líquido ao longo dos pulmões. Usando a técnicademonstrámos deposição uniforme da proteína injectada ao longo das vias aéreas e alvéolos dos ratinhos 14. A técnica de transfecção de lípidos permite o uso de uma pequena quantidade de proteína para alcançar o efeito. Isto limita a resposta inflamatória, que de outra forma seria provocada por administração da proteína. De fato, usando esta técnica nós publicamos que fomos capazes de aumentar significativamente a atividade PP2A no pulmão sem afetar pulmão celularidade do lavado 15. Lavagem pulmonar celularidade feita 24 horas após o desafio foi comparável com os controlos (27 ± 4 Controlo vs 31 ± 5 transfectada albumina, N = 6 por grupo). Além disso, aumenta os níveis de proteína sem induzir mudanças de desenvolvimento do pulmão ou mudanças de arquitectura que pode ocorrer em modelos transgénicos. No entanto, a necessidade de administrações repetidas podem tornar esta técnica menos favorável para estudos examinando os efeitos dos aumentos a longo prazo na expressão da proteína. Isto seria particularmente true de proteínas com uma meia-vida curta.
A vantagem desta técnica em relação a outros métodos é que produz aumentos dos níveis de proteína e de actividade dentro do próprio tecido do pulmão. Além disso, ele penetra para as regiões distais do pulmão em vez de ficar apenas dentro das vias respiratórias. Nós medimos o aumento da atividade da proteína do nosso injetado mesmo depois lavaging as vias aéreas com soro fisiológico 15. As análises de actividade de tecido indicam que a proteína é entrar nas células e não apenas permanecem…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (7R01HL098528-03) e Innovator Award Clínica FAMRI.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |