Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

Summary

Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen

Abstract

Beauveria bassiana eine Pilz Entomoerreger mit der Fähigkeit zu Pflanzen endophytisch kolonisieren. Als Endophyt, B. bassiana eine Rolle beim Schutz der Pflanzen vor Insektenfraß und Krankheit spielen. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden B. etablieren bassiana endophytisch in der gemeinen Bohne (Phaseolus vulgaris), in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Die Pflanzen werden von der Oberfläche sterilisiert Samen für zwei Wochen, bevor er eine B. gewachsen bassiana Behandlung von 10 ⁸ Sporen / ml (oder Wasser) angewendet entweder als Blattspray oder eines Bodens durchnässen. Zwei Wochen später werden die Pflanzen geerntet und ihre Blätter, Stängel und Wurzeln werden abgetastet, um endophytischen Pilzbesiedlung bewerten. Hierzu werden Proben einzeln sterilisiert Oberfläche geschnitten in mehrere Abschnitte und inkubiert in Kartoffeldextroseagar Medium für 20 Tage. Die Medien kontrolliert wird alle 2-3 Tage, um Pilz-Wachstum zu beobachtensociated mit Anlagenteilen und notieren das Auftreten von B. bassiana zu schätzen den Umfang ihrer endophytischen Kolonisation. Analysen der Impfung Erfolg vergleichen das Auftreten von B. bassiana innerhalb einer bestimmten Anlagenteil (dh Blätter, Stängel und Wurzeln) über Behandlungen und Kontrollen. Neben der Impfung Verfahren, das konkrete Ergebnis des Experiments kann auf die Zielkultur Art oder Sorte abhängen, belasten die Pilz Entomoerreger Arten oder isolieren verwendet, und die Pflanze Anbaubedingungen.

Introduction

Fungal Entomopathogens sind wichtige Regulatoren der Insekten-Populationen mit erheblichem Potenzial als mycopesticides ^1. Erst kürzlich haben jedoch gezeigt worden pilzlichen Entomoerreger als Endophyten, sowohl natürlich als auch in Reaktion auf verschiedene Methoden Inokulation ² auftreten. Die ökologische Funktion der endophytischen Pilz Entomopathogens weitgehend unbekannt, aber einige Studien haben sie in das Pflanzenwachstum ^3,4, Pflanzenfresser Widerstand ^5-8 und Krankheitsresistenz ^9,10 verwickelt. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, ein Pilz Entomoerreger als Endophyten einzuführen, in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) ist die am besten untersuchte endophytischen Pilz Entomoerreger ^5-9,11-19, und es ist als kommerzielles mycopesticide. Inokulation Methoden getestet, um festzustellen 14,17, Samenbeschichtungen ¹⁸ und Tauchgänge ^14, radicle Dressings ^13,15, Wurzel und Rhizom Tauchgänge ^11,16,18, Stammzellen-Injektionen ^17, Blattsprays ^14,17,20 und Blüten Sprays ^19. Mit Hilfe dieser Methoden haben die Forscher B. eingeführt bassiana in Bananenblätter ^11, bean ^7, Kakao ^13, Kaffee ^17, Mais ^7, Baumwolle ^7, Dattelpalme ^12, Jute ^21, Schlafmohn ^20, Kürbis ^7, radiata Kiefer ^18, Sorghum ^14, Tomate ⁷ und Weizen ^7. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass endophytischen B. bassiana hat das Potential, nicht nur aus Pflanzen Arthropodenschädlinge ^5-7,22-27 schützen, sondern auch aus einigen Pflanzenpathogene ^9.

Die gemeinsame Bohne (Phaseolus vulgaris) gehört zu den Pflanzen besonders anfällig für Schädlingeund Krankheiten. Es kann durch mehr als 400 Schädlinge und 200 Erreger, dessen Angriff wird angenommen, dass die Begrenzung der bean Produktionsfaktor in den Regionen ²⁸ werden betroffen sein. Dementsprechend kann der gemeine Bohne ein hervorragendes Modell Ernte sein, um das gesamte Spektrum der endophytischen biologische Kontrolle von B. zu untersuchen bassiana. Als ersten Schritt in diese Richtung, beschreibt dieser Artikel Blattsprays und Boden durchnässt als Impfung Methoden B.bassiana als Endophyten in der gemeinen Bohne vorstellen.

Protocol

Ein. Pflanzen

1. Oberflächenaktive sterilisieren Bohnensamen (cv. Calima) durch Eintauchen für zwei Minuten in 0,5% Natriumhypochlorit und zwei Minuten in 70% Ethanol. Spülen Sie die Samen dreimal in sterilem destilliertem Wasser.
2. Bewerten Sie den Erfolg Ihrer Sterilisation durch Ausplattieren 100 ul der letzten Spülwasser auf Kartoffel dextroxe Agar (PDA) Medien und Inkubation der Platte für 10 Tage bei 25 ° C. Beenden und neu starten das Experiment, wenn kein Wachstum auf der Platte zu sehen ist.
3. Pflanzen die Samen in Gruppen von drei in Töpfen mit einer sterilen Mischung von Erde und Sand im Verhältnis 2:1. Übertragen der Töpfe in eine Wachstumskammer bei 25 ° C, ca.. 50% RH und 12 h Photoperiode. Eine Woche nach der Keimung, beseitigen die beiden mindestens kräftige Sämlinge. Wasser alle 2-3 Tage mit sterilem destilliertem Wasser und düngen 10 und 20 Tage nach der Pflanzung mit einem 6 g / L Wasser-Lösung von NPK 15-15-15 Dünger.

2. Pilz

1. Besorgen Sie sich eine komsoziale Formulierung Beauveria bassiana Stamm GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Kolumbien).
2. Um eine einzelne Sporen Stammkultur erzeugen, auszusetzen ca. ein Impföse voll von Konidien in 1 ml einer 0,1% igen wässrigen Lösung von Triton-X 100 und Vortex für 10 Sekunden. Dann Platte 100 ul der Suspension auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden bei 25 ° C. Übertragen einer einzigen keimenden Konidien in eine 100 mm Platte mit PDA und wachsen, bis sie die gesamte Platte (ca. 3-4 Wochen) abdeckt.
3. Unter sterilen Bedingungen, kratzen die Pilzwachstum von der Oberfläche des Mediums und suspendieren in 10 ml steriler 0,1% Triton X-100. Vortex für eine Minute. Dann filtern die Suspension durch eine sterile Gaze um Hyphen zu entfernen und die Stoffsuspension.
4. Verwenden Sie eine Zählkammer die Konidien Konzentration der Stoffsuspension zu schätzen. Um Konidien zählt zu erleichtern, bereiten eine 10.000-fach Verdünnungsreihe der Aktie, jedes Mal, wenn die Übertragung 100 ul of Konidienaufschwemmung in 900 ul 0,1% Triton-X 100 und Vortexen für 10 Sek. vor der nächsten Verdünnung.
5. Um das Inokulum zu erzeugen, Einstellen der Stoffsuspension auf eine Endkonzentration von 10 ⁸ Sporen / ml, nach der Formel:
   
6. Um Konidien Lebensfähigkeit Platte 100 ul der 10.000-fachen Verdünnung auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden zu beurteilen bei 25 ° C. Dann untersuchen drei zufällige Gruppen von 100 Konidien auf Prozent der Keimung zu schätzen. Betrachten wir ein Conidium gekeimt wenn eine sichtbare Keimschlauch länger als die Hälfte des Durchmessers der Conidium Projekte daraus. Verwenden Sie nur die Aussetzung, wenn die durchschnittliche prozentuale Keimung 90% übersteigt.

3. Impfung

1. Beimpfen Pflanzen, wenn sie ihre erste echte Blatt-Stadium (ca. 14 Tage nach dem Einpflanzen) zu erreichen. Wasserpflanzen zu Boden Kapazität mit sterilen destillierened Wasser 24 Stunden vor Impfungen.
2. Für die Blatt-Sprühverfahren, verwenden eine manuelle Zerstäubers um die Konidienaufschwemmung (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) der adaxial (oberen) Oberfläche der Blätter bis sie Sättigung erreichen anzuwenden. Decken Sie die Oberseite des Topfes mit Aluminiumfolie Konidien Abfluss in den Boden vermeiden. Nach dem Aufsprühen decken Pflanzen mit einer Plastiktüte für 24 Stunden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erleichtern Pilz Invasion zu halten.
3. Für den Boden drench Verfahren, verwenden Sie einen Meßzylinder auf 10 ml Konidiensuspension (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) auf die Oberfläche des Bodens auf der Basis der Pflanze. Gelten
4. Nach Impfungen, zurückzukehren Pflanzen zu den Klimakammern ordnet sie in einer randomisierten vollständigen Block-Design. Nicht weniger als vier zusätzliche experimentelle Blöcken installiert werden, um Auswertungen des Pflanzenwachstums zu ermöglichen, zusätzlich zu Auswertungen endophytischen Kolonisierung im gleichen Experiment.

4. Evaluations

1. Auswertung des Versuchs ein Block in einer Zeit, die Auswahl der Blöcke in zufälliger Reihenfolge. Dies ist insbesondere wichtig für große Experimente, die nicht an einem einzigen Tag ausgewertet werden können.
2. Vor der Verarbeitung einer Pflanze, messen und aufzeichnen seine Höhe von der Basis zu dem apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und gründlich unter fließendem Leitungswasser.
3. Von jeder Pflanze, Probe zwei Blättchen, zwei Stücke von Wurzel und zwei Stücke von Stammzellen. Wählen Sie Broschüre Proben zufällig aus der ersten echten Blatt der Pflanze. Dann erhält man zwei Proben Schaft, 3 cm langen jeweils von der Mitte der Pflanze und von der Nähe der Bodenoberfläche. Schließlich erhalten zwei taproot Proben, auch 3 cm lang jeweils von der Mitte der Wurzel und von 1 cm hinter der Wurzelspitze. Legen Sie die Proben auf drei separaten Papiertüten und Label angemessen.
4. Nach dem Waschen und Abtasten aller Pflanzen in einem Block, durch Verarbeiten der Blätter startet, dann Wurzeln, und schließlich werden die Stiele.
5. Oberfläche zu sterilisieren tFragen in einem sterilen Laminarströmungshaube wie in 1,1 oben. Spülen Sie jede Probe dreimal durch Eintauchen in sterilem destilliertem Wasser und lassen es trocken in sterilen Tuch Papier. Dann zerlegen und entsorgen ihren äußeren Rändern, wo Endophyten beseitigt haben könnten aufgrund der mit Desinfektionsmitteln zu kontaktieren.
6. Schneiden Sie den getrimmt Probe in sechs Abschnitte mit durchschnittlich 6x6 mm für Blätter und 6 mm-lange Stängel und Wurzeln. Platte die sechs Abschnitte über eine 60 mm Petrischale mit PDA Medien mit dem Antibiotika Tetracyclin, Streptomycin und Penicillin bei 2 mg / L jeweils ergänzt. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren im Dunkeln bei 25 ° C. Jede Pflanze liefert sechs Platten, zwei pro Anlagenteil.
7. Anderer das Wasser nach der Verarbeitung jedes Blocks eines gegebenen Pflanzenteil spülen. Vor der Entsorgung des verwendeten Spülwassers, Platte eine 100 ul Probe auf PDA Medien und inkubieren für 10 Tage bei 25 ° C zu beurteilen Sterilisation Erfolg. Wenn Pilzwachstum erfolgt, berücksichtigen nicht die entsprechenden Proben für Analysen.
8. Überprüfen Sie die Platten alle 2-3 Tage für 20 Tage zu beobachten und aufzuzeichnen Pilzwachstum. Verbrauchsteuern und Transfer Anlagenteile ausstellenden Vorhandensein von Pilz-Endophyten auf Platten mit frischem PDA. Dies wird eine Kontamination benachbarter Anlagenteile in der Original-Platte.
9. Rekord B. bassiana Wachstum von Anlagenteilen. Beauveria bassiana kann durch charakteristische weiße dichten Myzel immer cream bis blassgelb am Rande identifiziert werden. Wenn Sie Zweifel haben, montieren Sie die Probe in einem Tropfen Wasser und überprüfen unter dem Mikroskop auf der Suche nach globose Konidien und Zick-Zack-förmigen Konidienträgern, charakteristisch für die Spezies.
10. Verwenden Sie zusätzliche experimentelle Blöcke, um die Auswirkungen der Behandlungen auf pflanzlicher Biomasse zu evaluieren. Zunächst messen deren Höhe von der Basis bis zur Spitze des apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und waschen Pflanzen in Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen bei 45 ° C für drei Tage, um ihre Trockengewicht zu bestimmen.

Representative Results

B. bassiana konnte endophytisch besiedeln P. vulgaris in Reaktion auf die Impfung nachgewiesen Behandlungen (Abbildung 1). Beide Blattsprays und Boden durchnässt führte endophytischen Besiedlung durch B. bassiana in über 80% der behandelten Pflanzen (Abbildung 2). Allerdings hing das Ausmaß der Besiedelung auf der Anlage Teil ausgewertet und die Impfung Methode verwendet. Leaves reagiert am besten auf spray Impfungen. Wurzeln, auf der anderen Seite, reagiert nur zu durchnässen Impfungen. Schließlich Stiele ähnlich beiden Inokulation Methoden reagiert. B. bassiana wurde in keinem der Steuerdaten Anlagenteile erfasst.

Unabhängig von der Behandlung, mit Ausnahme von B. Endophyten bassiana wuchs von 15% der ausgewerteten Anlagenteile, aber sie wurden aus den Medien Platten zerlegt, bevor sie angrenzenden Abschnitte könnten eindringen und die Ergebnisse beeinflussen.

Behandlung und Kontrolle Pflanzen waren sichtlich unterscheiden zwei Wochen nach Impfungen. Es wurden keine Unterschiede in ihrer Trockengewicht und in ihrer Höhe festgestellt.

Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung der Bohne (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Durch Beauveria bassiana Oben links:. Kontrollplatten ohne Wachstum. Oben rechts: Fungal Endophyten aus einem Anlagenteil verunreinigen gesamte Platte. Unten links: B. bassiana wächst aus zwei Anlagenteilen. Unten rechts: Endophytic B. bassiana Konidien und Konidiophoren wie unter einem Mikroskop betrachtet.

Abbildung 2. Wirkung der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung bean (Phaseolus vulgaris cv. Calima) von Beauveria bassiana, zwei Wochen nach Impfung mit dem Stamm GHA. Prozent Kolonisierung repräsentiert die Anzahl der besiedelten Anlagenteilen durch die Anzahl der gebildeten Abschnitte unterteilt.

Discussion

Viele Faktoren können Einfluss auf die konkrete Ergebnis eines Experiments, eine Pilz Entomoerreger als Endophyten zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Inokulation Verfahren ist eines davon. Biologische Faktoren zu experimentieren sind die Pflanzenart oder Sorte ausgewählt und die Pilz Entomoerreger Arten Belastung oder isolieren. Andere Faktoren zu berücksichtigen Manipulation beinhalten die Konzentration des Inokulums, das Alter der Anlage während Impfungen und der Anlage Anbaubedingungen.

Es wäre ideal für eine Impfung Methode der systemischen pflanzlichen Kolonisation durch eine Pilz Entomoerreger ^14,17,18,21 führen. Stattdessen geht hervor, dass Methoden zur Inokulation ein spezifisches Muster von lokalen Kolonisierung bevorzugen. In Kaffee beispielsweise begünstigen Blattsprays Blatt Kolonisierung Erwägung Boden Drenchen Wurzelbesiedlung ¹⁷ begünstigen. Wir fanden das gleiche Muster in der gemeinsamen Bohne. Letztlich sollte die Wahl der Impfung Methodegeleitet von dem vorgesehenen Standort des Endophyten innerhalb einer Anlage, vermutlich passenden Nische des Ziels Herbivore oder Pflanzenpathogen.

Obwohl häufig verwendet, Endophyten Detektion und Quantifizierung basierend auf Medienkulturen kann teuer werden, schwierig und fehleranfällig. Beispielsweise wurden insgesamt 10.800 Teilanlagen (plattiert auf Petrischalen 1800) in einem Experiment evaluiert nach B. optimieren bassiana Impfungen auf Banane ^16. Von diesen wurden 4.496 Abschnitte durch eine vermeintliche B. kolonisiert bassiana, wie sie vor allem durch Kolonie Morphologie identifiziert. Natürlich wäre eine mikroskopische Überprüfung der Arten für jede Kolonie eine wünschenswerte, aber nicht finanzierbare Schritt. Auf der anderen Seite wurden 1176 Teile von anderen Pilzen besiedelt und wurden verworfen und behandelt wie fehlende Daten ^16. Die Wahrscheinlichkeit besteht jedoch, dass B. bassiana war ein armer Konkurrenten oder langsamer zu wachsen, und konnte schließlich aus diesen Abschnitten entstanden sind, wenn einllowed genügend Zeit. Daher sind Endophyten Nachweisverfahren auf Medienkulturen Basis unterliegen falsche Positive und falsche Negative. Dementsprechend ist die Entwicklung zuverlässiger Nachweis und die Quantifizierung Methoden, beispielsweise solche auf Basis von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays ^20,21,24, ist gut begründet.

Das ultimative Ziel für Impfversuche sollte es sein, eine effiziente Behandlung, die dauerhaft systemische Resistenz gegen Insektenfraß und / oder Krankheit zu entwickeln. Eine plausible, aber noch nicht getestet, ist Hypothese, dass das Ausmaß der endophytischen Kolonisierung sollte positiv korreliert mit dem Ausmaß der Endophyten-vermittelte Resistenz. Eine natürliche nächste Schritt nach Verfeinerung Impfung Methoden, daher könnte es sein, diesen Zusammenhang zu untersuchen. Mehrere Video-Protokolle können Forschern helfen entwerfen eine geeignete Resistenzassay für ein Ziel Schädlings oder Krankheitserregers ^29-31. Letztlich ist es dieser Assay, was den Erfolg der Inokula bestimmenmethode und die damit verbundene Potenzial für endophytischen biologische Kontrolle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A